Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
agarose gels, Nucleic Acids Res., 5, 2321.
26. Быстрая оценка концентрации ДНК с бромистым этидием
133
Методика 26
Быстрая оценка концентрации ДНК с использованием бромистого этидия
I. Метод с использованием чашки с агарозой
1. В чашки Петри разлейте по 10 мл 1%-ного раствора агарозы с 0,5 мкг/мл
бромистого Этидия в любом удобном буфере с низкой концентрацией соли
(можно использовать, например, оставшийся после приготовления геля
раствор).
2. На чашку с агарозой нанесите каплей 1-10 мкл того раствора ДНК,
концентрацию которого, нужно определить.
3. Каплями нанесите такие же объемы каких-нибудь препаратов ДНК с
известной концентрацией. Наносите их в определенном порядке, начиная с
концентрации около 0,5 мкг/мл и вйлоть до 20 мкг/мл.
4. Оставьте чашки, чтобы капли впитались в агарозу. (Чашки оставляют на
разное время - начиная с 15 мин и кончая пе(-рерывом в работе на ночь.).
5. Сфотографируйте под коротковолновым УФ-светом и сравните1
интенсивность флуоресценции.
6. Если концентрация ДНК в исследуемом препарате оказалась выше 20
мкг/мл, то сделайте несколько разведений и вновь сравните их с образцами,
концентрация которых известна.
7. Препарат ДНК может содержать небольшие молекулы, которые мешают
определить концентрацию ДНК, вызывая усиление флуоресценции (например,
небольшие молекулы РНК) или гася флуоресценцию бромистого этидия
(например, сахароза, ДСН, NaC104 или формамид). В этом случае оставьте
чашку на ночь, и тогда эти соединения, препятствующие определению
концентрации ДНК, диффундируют в окружающую агарозу.
II. Метод с использованием пластиковой пленки, натянутой на кольцо
1. Натяните пластиковую пленку на кольцо (например, на ободок пластиковой
чашки Петри с удаленным дном).
2. На пленку каплями одинакового объема нанесите растворы ДНК с 1 мкг/мл
бромистого этидия. Сравните капли, как было описано выше в методе I.
3. Для чистой ДНК лучшим оказывается метод II, а для препаратов ДНК с
примесью низкомолекулярных соединений, которые мешают определению
концентрации,- метод I.
134
Раздел II. Методики
Методика 27
Электронная микроскопия ДНК
1. Водная методика
A. Метод расправления
1. Расправляющий раствор. Используйте 30 мкл раствора:
5 мкл 5 М ацетата аммония и 1 мг/мл цитохрома с, 25 нг ДНК,
Н20 до конечного объема 50 мкл.
2. Нижняя фаза (0,25 М ацетат аммония).
Б. Метод капли
1. 3,5 мкл 5 М ацетата аммония и 1 мг/мл цитохрома с.
2. 25 нг ДНК.
3. Н20 до конечного объема 50 мкл. Поместите каплю на тефлон или любую
другую несмачиваемую поверхность. Коснитесь сеточкой боковой стороны
капли. Этот метод дает лучшие результаты в случае небольших ДНК
(например/ДНК фага фХ174 или вируса SV-40).
B. Окрашивание
1. В 10 мл 90%-ного этанола добавьте 10 мкл уранилацета-та (0,05 М
уранилацетат и 0,05 М НС1 в Н20).
2. Храните закрытым, в темноте.
3. Окрашивайте сеточки в течение 30 с.
4. Споласкивайте 5 с в 90%-ном этаноле.
Литература
Davis R. W., Simon М. N.. Davidson N.. 1971. Electron microscope
heteroduplex methods for mapping regions of base sequence homology in
nucleic acids, Methods Enzymol., 21D, 413.
Ferguson J., Davis R. W., 1978. Quantitative electron microscopy of
nucleic acids. In: Advanced techniques in biological electron microscopy
II (Koehler J. K., ed.), p. 123.
II. Формамидная методика
A. 1. Расправляющий раствор. Используйте 50 мкл раствора: 10 мкл 1 М
трис-НС1 (pH 8,5), 0,1 М Ыа2-ЭДТА и 0,5 мг/мл цитохрома с,
27. Электронная микроскопия ДНК
135
25 нг ДНК,,
Н20 до конечного объема 60 мкл,
40 мкл формамида.
2. Нижняя фаза (приготавливается не ранее чем за 5 мин до
использования):
0,01 М трис и 10_3 М Ыа2-ЭД'ГА (pH 8,5) (100 мл),
10%-ный формамид (10 мл).
Б. Окрашивание
1. В 10 мл 90%-ногО этанола добавьте 10 мкл основного раствора
уранилацетата (0,05 М уранилацетат и 0,05 М НС1 в Н20).
2. Храните закрытым, в темноте.
3. Окрашивайте сеточки в течение 30 с.
4. Промывайте по 5 с в 90%-ном этаноле.
В. Изоденатурирующие условия (для ряда расправляющих растворов и
нижних фаз)
Расправляющий раствор Нижняя фаза
1. 30%-ный раствор формамида 5%-ный раствор формамида 0,1 М трис (pH 8,5)
0,01 М трис (pH 8,5)
0,01 М Ыа2-ЭДТА 0,001 М Ыа2-ЭДТА
2. 40%-ный раствор формамида 10%-ный раствор формамида 0,1 М трис (pH
8,5) 0,01 М трис (pH 8,5)
0,01 М Naa-ЭДТА 0,001 М Ыа2-ЭДТА
3. 50%-ный раствор формамида 20%-ный раствор формамида 0,1 М трис (pH
8,5) 0,01 М трис (pH 8,5)
0,01 MNa2-3flTA 0,001 М Na2-3flTA
4. 60%-ный раствор формамида 30%-ный раствор формамида 0,1 М трис (pH
8,5) 0,01 М трис (pH 8,5)
0,01 М Ыа2-ЭДТА 0,001 М Naa-ЭДТА
5. 70%-ный раствор формамида 40%-ный раствор формамида 0,1 М трис (pH
8,5) 0,01 М трис (pH 8,5)
0,01 М Ыа2-ЭДТА 0,001 М Ыа2-ЭДТА
6. 80%-ный раствор формамида 50%-ный раствор формамида 0,05 М трис (pH
8,5) в дистиллированной воде
0,005 М Ыа2-ЭДТА
Литература
Davis R. W., Hyman R. W., 1971. A study in evolution: Homology between
coliphages T7 and T3, J. Mol. Biol., 62, 287.
