Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
и дегидро-бензойную кислоту, что необходимо для роста мутантов, у которых
блокирован синтез ароматических аминокислот.
6. Мутанты, у которых блокированы ранние стадии пути биосинтеза лизина,
растут только на смеси 4.
7. Смесь 11 удовлетворяет в основном потребности в витаминах.
8. Растворы приведенных выше смесей (1 -11) можно приготовить
концентрированными в 10 раз.
S*
148
Раздел III. Приложения
9. Используйте соли глутаминовой и аспарагиновой кислот.
10. Растворы глутамина и аспарагина не автоклавируйте.
11. Растворы, содержащие триптофан, храните в темноте.
12. Смесь 9 содержит 20 мМ глутамина, а смесь 1-только 5 мМ. Те штаммы,
которые нуждаются в высокой концентрации глутамина (например, мутанты
glnA), будут расти лишь на среде 9.
Приложение 3
Хранение бактерий, фагов и ДНК
I. Хранение бактерий и фагов
А. Хранение фагов
Обычно пользуются двумя методами хранения. Ауксо-трофы (в том числе со
вставками Тп 10) и множественно маркированные штаммы с относительно
стабильным генотипом можно хранить в столбиках во флакончиках при
комнатной температуре. Для мутантов со вставками Тп5, у которых
накапливаются дополнительные копии этого транспозона, данный метод
непригоден. Такие мутанты, штаммы Hfr и штаммы с нестабильными геномами
рекомендуется хранить при низкой температуре (-70°С), как это описано
ниже.
Б. Хранение фагов
Лизаты фага Р22 (методика 2) обычно стабильны при 4°С в хорошо
забуференной среде с кальцием и магнием. Лизаты мутанта НТ124 фага Р22
(мутант, характеризующийся повышенной частотой трансдукции) несколько
менее стабильны - возможно, из-за изменения структуры капсида под
действием мутации НТ. Лизаты фага К (см. методику 2) можно хранить при
4°С с каплей СНС13. Титр такого лизата, однако, может за год упасть на
порядок. В течение длительного времени препараты фагов Р22(НТ) и К хранят
при низкой температуре, как это описано ниже.
3. Хранение бактерий, фагов и ДНК
149
II. Методики хранения
4. Столбики во флакончиках при комнатной температуре
Флакончики Емкость ~ 2 мл (0,5 драхмы), размер 12x35 мм
Крышки Бакелитовые с резиновыми прокладками
Этикетки Для флакончиков, хранящихся при комнатной темпе-
ратуре, пользуйтесь этикетками Kum Klean. Этикетки Time и Shamrock не
отклеиваются при низкой температуре, и ими можно пользоваться и при
хранении при -70°С.
Среда Питательный бульон (Difco) 2 г
Агар 1,5 г
НгО 250 мл
Б. Подготовка флакончиков
Среду нагревают до полного расплавления агара. Пользуясь репетером,
разлейте ее по флакончикам (по 1,2 мл во флакончик). Закройте флакончики
крышками и автоклавируйте (они не лопаются). До использования храните
флакончики при 4°С.
В. Использование флакончиков
Ту культуру, которую хотите сохранить, внесите уколом в мягкий агар.
Пользуйтесь иглой аппликатора или иглой для инокуляции. Горлышко
флакончика с резьбой погрузите в расплавленный парафин и плотно заверните
крышку, пока парафин не застыл. Герметизация парафином предотвратит
высыхание. В таких флакончиках культуры могут храниться свыше 10 лет.
Г. Хранение фагов и бактерий при низкой температуре
Как фаги, так и бактерии можно хранить в 7%-ном растворе ДМСО (или в 15%-
ном глицерине) при -70°С. Для этого приготавливают стерильные пробирки с
70 мкл ДМСО (или 150 мкл глицерина). Во флакончик пипеткой наливают 1 мл
суспензии фага или свежей культуры бактерий и перемешивают. Флакончик
закрывают крышкой и помещают на -70°С.
Когда берете фаг или клетки из культуры, хранящейся при -70°С, не нужно
оттаивать флакончик. Откройте его и стерильной иглой поскребите
поверхность замороженного материала. Рассейте штрихом на подходящую среду
или бактериальный газон. Флакончик же можно опять закрыть крышкой и снова
поставить на -70°С.
III. Хранение ДНК
При обработке и хранении ДНК и РНК важно учитывать
следующие свойства реактивов и условий.
150
Раздел III. Приложения
1. Тяжелые металлы способствуют разрыву фосфодиэфирных связей.
2. Ца2-ЭДТА прекрасно хелатирует ионы тяжелых металлов.
3. При pH выше 7 цитрат уже не обладает буферной емкостью и лишь очень
слабо хелатирует металлы. Цитрат используют по причинам чисто
историческим, его использование не дает никаких преимуществ. Поэтому мы
от него отказались.
4. При облучении и в результате химического расщепления образуются
свободные радикалы. Они вызывают разрывы фосфодиэфирных связей.
5. УФ-лучи. Облучение светом с длиной волны 260 нм вызывает различные
повреждения, в том числе приводит к образованию тиминовых димеров и
поперечных сшивок. При этом падает биологическая активность. Облучение
светом с длиной волны 320 нм также вызывает образование поперечных
сшивок, но с меньшей эффективностью.
6. Диэтилпирокарбонат и диэтилоксидиформат. Эти соединения вызывают
включение в одноцепочечные нуклеиновые кислоты карбэтоксильных групп, что
приводит к утрате биологической активности. С двухцепочечными
нуклеиновыми кислотами они, как правило, не реагируют при комнатной
