Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
11. Совместив маркированную рентгеновскую пленку с исходной чашкой,
выявите те колонии, в которых произошла гибридизация.
Литература
Grunstein М., Hogness D. S., 1975. Colony hybridization: A method for the
isolation of cloned DNAs that contain a specific gene, Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961.
Методика 22
Внесение метки a-32P в ДНК с помощью ник-трансляции
Объемы приведены из расчета, что реакцию проводят в 25 мкл. Буфер для
ник-трансляции
50 мМ трис- НС1 (pH 7,5)
10 мМ MgS04 1 мМ ДТТ 50 мкг/мл БСА
I. Реакция
I. Н20; объем = 20 мкл-(объем раствора ДНК, добавленного в пробирку от
микрофуги).
122
Раздел II. Методики
2. 2,5 мкл буфера NT для ник-трансляции 10Х:
0,5 М трис (pH 7,5)
0,1 MMgS04 10 мМ ДТТ 500 мкг/мл БСА
3. 2,5 мкл раствора, содержащего по 0,2 мМ всех dNTP, кроме того, который
мечен 32Р.
4. 0,5 мкг ДНК (или менее).
5. 0,5 мкл разведенной ДНКазы (см. разд. III в данной методике) .
6. Перенесите эту реакционную смесь в пробирку от микрофуги, в которой
находится dNTP, меченный 32Р (см. разд. II данной методики).
7. 0,1 мкл раствора очищенной до гомогенности ДНК-полиме-разы I Е. coli с
концентрацией 2 мг/мл.
8. Инкубируйте около 3 ч при 14°С.
Обычно реакция протекает следующим образом. В начальный период включения
метки не происходит, затем следует быстрое линейное увеличение включения,
замедление включения, плато, а затем снижение количества включенной
метки, причем иногда оно происходит быстро. Прекращайте реакцию на стадии
замедленного роста включения или на стадии плато. В ДНК должно включиться
по крайней мере 25% метки.
9. Остановите реакцию. Добавьте 25 мкл раствора:
0,02 М Иаз-ЭДТА.
2 мг/мл ДНК-носителя (обработанной ультразвуком тимусной ДНК)
0,2% ДСН.
II. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP)
1. Немеченые dNTP: конечная концентрация в 25 мкл равна 20 мкМ.
2. 32P-dNTP (обычно dCTP). Сполосните полипропиленовую пробирку от
микрофуги на 1,5 или 0,5 мл этанолом, высушите. В эту пробирку внесите
меченный 32Р dNTP в 50%-ном этаноле. Закройте пробирку парафильмом. В
пленке сделайте три-четыре отверстия. Высушите под вакуумом при комнатной
температуре. Конечная концентрация в 25 мкл равна 1- 5 мкМ (~50 мкКи).
III. ДНКаза
1. Исходный раствор: ДНКаза в концентрации 1 мг/мл в 50 мМ трис (pH 7,5),
10 мМ MgS04, 1 мМ ДТТ и 50% глицерола при -20°С.
2. 0,5 мкл исходного раствора ДНКазы разводят до 100 мкл буфером для ее
разведения [50 мМ трис (pH 7,5), 10 мМ
22. Внесение метки в а-32Р ДНК с помощью ник-трансляции 123
MgS04, 1 мМ ДТТ, 50 мкг/мл БСА]. 0,5 мкл этого разведенного раствора
разводят дальше. Разведения проводят при 0°С.
а. Чтобы получить зонд для гибридизации, 0,5 мкл этого раствора разводят
в 100 мкл (общее разведение 1 :40 000). Длина дуплексов в зонде
оказывается менее 5 kb.
б. Для получения меченой двухцепочечной ДНК длиной 20 kb 0,5 мкл разводят
в 1 мл (общее разведение 1 : 400 000).
IV. Проверка включения 32Р в ДНК
1. Добавьте <0,1 мкл реакционной смеси в стеклянную пробирку на 5 мл,
содержащую 100 мкл ДНК-носителя с концентрацией 500 мкг/мл,
2. Отберите 10 мкл и капните их на фильтр GFC диаметром 24 мм.
3. а. К остальной пробе добавьте 1 мл 1 М НС1 и 0,1 М пиро-
фосфата натрия.
б. Пробу подержите во льду в течение 10 мин.
в. Фильтруйте через фильтр GFC диаметром 24 мм. Промойте НС1, затем
этанолом.
4. Высушите оба фильтра.
5. Просчитайте на ручном счетчике или на более точном счетчике.
6. Если оба фильтра считают одинаково, то эффективность включения
составляет 10%. Обычно включение составляет 25-50%.
V. Выделение меченой ДНК
А. 1. Нанесите реакционную смесь на колонку 0,7X20 см (Bio-Rad Econo-
column) с сефадексом G-50, предварительно уравновешенным буфером ТЕ (10
мМ трис и 1 мМ Каз-ЭДТА, pH 7,5). Сухой сефадекс G-50 набухает 3 ч.
2. Промойте буфером ТЕ (10 мМ трис и 1 мМ Ыа3-ЭДТА, pH 7,5).
3. Вытекающую жидкость собирайте порциями по 0,5 мл в полипропиленовые
пробирки. ДНК обычно элюируется после 2. мл промывки. За положением ДНК,
меченной 32Р, в колонке можно следить, пользуясь ручным счетчиком.
4. Соберите первый пик, отбросив хвост.
Б. 1. Проколите крышку и дно полипропиленовой центрифужной пробирки на
0,5 мл иглой номер 27. (Сделайте одно отверстие в дне и четыре в крышке).
2. Вставьте проткнутую пробирку в полипропиленовую центрифужную пробирку
на 1,5 мл со снятой крышкой.
3. Во внутреннюю пробирку внесите 100 мкл биогеля Р60
124
Раздел //. Методики
(50-100 меш), суспендированного в 10 мМ трис (pH 7,5), 1 мМ Ыаз-ЭДТА,
0,2% ДСН.
Сверху наслоите 300-400 мкл биогеля Р60 (100- 200 меш), суспендированного
в том же буфере.
4. Всю эту конструкцию из пробирок поставьте в клиническую центрифугу
(если необходимо, все это можно поместить в другую пробирку).
а. Центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 об/мин:
б. Добавьте 100 мкл буфера для промывки: 10 мМ трис (pH 7,5), 1 мМ Цаз-
ЭДТА, 0,2% ДСН.
в. Центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 об/мин.
г. Внутреннюю пробирку вставьте в чистую наружную пробирку.
