Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
Davis R. W., Simon M. N., Davidson /V., 1971. Electron microscope
heteroduplex methods for mapping regions of base sequence homology in
nucleic acids, Methods Enzymo'l., 21D, 413.
136
Раздел II. Методики
Методика 28
Обычная методика образования гетеродуплексов
I. Образование гетеродуплексов
1. 20 мкл Н20 (минус объем препарата фага или ДНК).
2. 0,1 мкг каждой ДНК (можно в виде фага).
3. 0,5 мкл 1 М Ма4-ЭДТА.
4. 2,5 мкл 1 М NaOH.
5. Выдержите в течение 10-30 мин при 25°С.
6. 2,5 мкл 1,8 М трис-HCl и 0,2 М трис-основание (pH 7,2).
7. 25 мкл формамида.
8. Инкубируйте в течение 20-60 мин при 25-40°С.
II. Электронная микроскопия гетеродуплексов
А. Расправляющий раствор
1. 10 мкл препарата гетеродуплексов.
2. 10 мкл раствора, содержащего 1 М трис, 0,1 М Ма2-ЭДТА
(pH 8,5) и 0,5 мг/мл цитохрома с.
3. 45 мкл Н20.
4. 35 мкл формамида.
5. Наливайте 50 мкл.
Б. Нижняя фаза (приготавливается не ранее, чем за 5 мин до использования)
0,01 М трис и 10~3 М Ыа2-ЭДТА (pH 8,5), 10%-ный раствор формамида.
Литература
Davis R. W., Davidson N., 1968. Electron-microscopic visualization of
deletion mutations, Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 243.
Davis R. W" Simon M. N., Davidson N" 1971. Electron microscope
heteroduplex methods for mapping regions of base sequence homology in
nucleic acids, Methods Enzymol., 21D, 413.
Ferguson I., Davis R. W., 1978. Quantitative electron microscopy of
nucleic acids. In: Advanced techniques in biological electron microscopy
II (Koehler J. K., ed.), vol. 2, p. 123, Springer-Verlag, Berlin.
Westmoreland В. C., Szybalski W" Ris H" 1969. Mapping of deletions and
substitutions in heteroduplex DNA molecules of bacteriophage lambda by
electron microscopy, Science, 163, 1343.
29. Выделение ферментов из %с1857-клеток
137
Методика 29
Выделение ферментных препаратов из клеток, лизогенных по фагу Ат 1857
5аш7
I. Методики, общие для всех ферментов
A. Выращивание клеток и индукция
Вырастите клетки в бульоне LB или в среде с дрожжевым экстрактом Ardamine
Z и Cerelose В1 (Panasenko et al., 1978). Клетки выращивайте при 30°С до
мутности А60о = 0,6 (при усиленной аэрации можно выращивать до мутности
1,0). В течение 15-20 мин прогрейте культуру при 42°С, а затем
выращивайте еще в течение 2,5-3 ч при 37°С. Следите за тем, чтобы в
процессе роста поддерживалось рН>7.
Б. Сбор клеток
Осадите клетки центрифугированием, взвесьте пастообразный осадок клеток.
Ресуспендируйте клетки в 1/100 исходного объема раствора, содержащего 50
мМ трис-HCl (pH 7,5) и 10% сахарозы. Заморозьте, опустив в жидкий азот, и
храните при температуре -70°С.
B. Лизис
Используйте методику лизиса в тепле (Scott and Korn-berg, 1978). Дайте
клеткам оттаять и добавьте такое количество раствора триса с сахарозой,
чтобы на 1 л лизирую-щего буфера приходилось 150 г клеток. При этом
оставьте место, чтобы можно было добавить сульфат аммония до 5%
насыщения, спермидин-С13 до 20 мМ,
Ма2-ЭДТА до 29 мМ,
ДТТ до 1 мМ.
Сухим или 2М трис-основанием доведите pH до 8. Добавьте лизоцим до
концентрации 0,2 мг/мл и инкубируйте во льду в течение 30 мин. Для
достижения полного лизиса прогревайте порциями по 250 мл в водяной бане
на 37°С в течение 5 мин (температура препарата при этом возрастет не до
37СС, а всего лишь примерно до 15°С) .
Лизат центрифугируйте в течение 3 ч при 20 000 об/мин в роторе JA-20, в
течение 90 мин при 25 000 об/мин в роторе SW-27 или в течение 60 мин при
40 000 об/мин в роторе 60 Ti или 45 Ti.
138
Раздел II. Методики
Литература
Panasenko S. М., Alazard R. Lehman I. P., 1978. A simple threestep
procedure for the large scale purification of DNA ligase from a hybrid X
lysogen constructed in vitro, J. Biol. Chem., 253, 4590.
Scott J. F., Kornberg A., 1978. Purification of the rep protein of
Escherichia coli, J. Biol. Chem., 253, 3292.
II. Очистка ДНК-полимеразы I из лизата клеток Е. coli 594 (см. список
штаммов)
A. Фракционирование
К надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония в концентрации 5% от
насыщения, добавьте сухой сульфат аммония (0,25 г/мл). Помешивайте 1 ч
при 4°С, после чего центрифугируйте в течение 30 мин при 10 000 об/мин в
роторе JA-14. Осадок отбросьте. К надосадочной жидкости, которая содержит
сульфат аммония в концентрации 47% от насыщения, добавьте сухой сульфат
аммония (0,16 г/мл), пе--ремешайте и центрифугируйте (Richardson et al.,
1964). Осадок ресуспендируйте в буфере, содержащем 200 мМ NaP04 (pH 6,5)
и 1 мМ ДТТ. Разведите так, чтобы ионная сила раствора стала приемлемой, и
пропустите его в этом же буфере через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой DE-52
(объемом 0,5- 1,0 мл на 1 г клеток).
Б. Хроматография на фосфоцеллюлозе
То, что протекло через ДЭАЭ-целлюлозу DE-52, диализуйте против 20 мМ КР04
(pH 6,5) и 1 мМ ДТТ. Нанесите на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 (объемом
0,5-1,0 мл на 1 г клеток), уравновешенной тем же буфером. Промойте таким
количеством буфера 20 мМ, который равен объему колонки, а затем таким же
