Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
максимального выхода нужно, чтобы гель полностью растворился. Поэтому
инкубируйте в течение 30-60 мин.
5. Поместите фильтр ватман GFC диаметром 8 мм в стеклянный аппарат для
фильтрования. Включите слабый вакуум и автоматической пипеткой нанесите
на фильтр GFC 1 мл буфера РРЕ. Подберите такое разряжение, чтобы скорость
протекания была около 0,5 мл/мин.
6. Нанесите растворенный образец на фильтр GFC. Поддерживайте скорость
протекания около 0,5 мл/мин.
7. Сполосните пробирку, в которой находился образец, 1 мл РРЕ и нанесите
эту жидкость на фильтр.
8. Сполосните фильтр 1 мл РРЕ, а затем 2-3 мл 100%-ного этанола при
комнатной температуре (скорость протекания при желании можно увеличить).
9. Удалите избыток жидкости, но не высушите фильтр.
10. Сложите фильтр в четыре раза. Положите его в пробирку от микрофуги на
0,5 мл, дно которой проколото иглой номер 27. Довольно плотно затолкайте
фильтр на дно пробирки. Эту пробирку с фильтром поместите в пробирку от
микрофуги на 1,5 мл со снятой крышкой.
11. Элюируйте ДНК с фильтра, добавив к нему 10-20 мкл буфера ТЕ (10 мМ
трис и 1 мМ Па2-ЭДТА, pH 7,5). Оставьте фильтр намоченным примерно на 1
мин. После этого поместите пробирки в микрофугу и центрифугируйте в
течение 15 с. В пробирке на 1,5 мл ДНК окажется на дне. Два раза
добавляйте по 10-20 мкл ТЕ и центрифугируйте. Элюируе-
25. Выделение ДНК из агарозного геля
131
мая в ТЕ ДНК расщепляется большинством рестриктирую-щих эндонуклеаз.
Буфер РРЕ: 6 М NaC104> 50 мМ Naj.eHj 6Р04 (pH 7), 10 мМ Nas-ЭДТА.
Обсуждение
1. Эта методика основана на том, что при высокой концентрации NaC104 ДНК
прилипает к фильтрам GFC.
2. Может оказаться существенным источник NaC104. Некоторые, партии NaC104
препятствуют связыванию ДНК с фильтрами.
3. Наличие Р04 в растворе NaC104, по-видимому, повышает выход ДНК. В
отсутствие Р04 некоторое количество ДНК остается на фильтре и не
элюируется с него.
4. Фильтр GFC диаметром 8 мм связывает 2 мкг ДНК- Емкость фильтра прямо
пропорциональна используемой площади.
5. Для ДНК меньших размеров выход выше. Обычно выход таков:
Размер ДНК, kb
40 000 10 000 5000
< 1000
Литература
Cheti С. W., Thomas С. A., Jr., 1980. Recovery of DNA segments from
agarose gel, Anal. Biochem., 101, 339.
McDonell M" St. John Т. (личное сообщение).
II. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности KI
1. Отделите нужный фрагмент, проведя электрофорез в агарозном геле.
Используйте трис-ацетатный или трис-фосфатный буфер (см. методику 20),
содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
2. Осветите длинноволновым УФ-светом лишь небольшую полоску геля, чтобы
УФ не повредил основной гель. Вырежьте кусочек геля, содержащий ДНК, и
взвесьте его.
3. Растворите гель в насыщенном растворе KI-
4. Добавьте бромистый этидий до конечной концентрации около 50 мкг/мл.
5. Доведите плотность до 1,5 г/мл.
Показатель преломления т)2о = 0,1731 -р +1,1617 (выполняется для 1,3^р^
1,7).
Выход., %
40-65
50-75
50-80
50-90
132
Раздел II. Методики
6. Центрифугируйте до достижения равновесия при 30 ООО об/мин и 20°С в
течение 24-48 ч.
Литература
Blin N., Gabain А. V., Bujard II.. 1975. Isolation о! large molecular
weight DNA from agarose gels for further digestion by restriction
enzymes, FEBS Lett., 53, 84.
III. Электроэлюция ДНК в гидроксилапатит
1. С помощью электрофореза в агарозном геле отделите .нужный фрагмент.
Используйте трис-ацетатный * буфер (методика 20), содержащий 0,5 мкг/мл
бромистого этидия. Слейте из аппарата столько буфера, чтобы поверхность
геля оказалась выше его уровня.
2. Осветите гель длинноволновым УФ-светом и разглядите по-. лосы ДНК.
Непосредственно перед нужной полосой вырежьте
лунку шириной 1-2 мм.
3. Заполните эту лунку плотной взвесью гидроксилапатита НТР Bio-Rad (в
трис-ацетатном буфере для электрофореза). Заполните лунку доверху,
добавляя взвесь по мере осаждения частиц.
4. Осторожно залейте гель буфером и продолжайте электрофорез. Освещая
гель длинноволновым УФ-светом, следите за движением полосы ДНК из геля в
гидроксилапатит.
5. После того как полоса полностью выйдет из геля, прекратите
электрофорез. Пользуясь пастеровской пипеткой, перенесите гидроксилапатит
в другую пастеровскую пипетку, которая заткнута силиконизированной
стеклянной ватой и закреплена таким образом, что получилась маленькая
колонка.
6. Промойте эту колонку пятью объемами (обычно 5 раз по 200 мкл) буфера
10 мМ КР04 (pH 6,8) с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Промойте еще пятью
объемами буфера 100 мМ КР04 с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
7. Элюируйте ДНК буфером 400 мМ КР04 с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
Собирайте небольшие фракции (~50 мкл) и следите за флуоресценцией под
длинноволновым УФ-светом.
8. Объедините фракции, которые содержат ДНК. Проведите экстракцию
фенолом, насыщенным буфером.
9. Отберите водную фазу. Диализуйте ее в течение ночи против 10 мМ трис-
НС1 (pH 8) и 1 мМ Каз-ЭДТА.
Литература
Tabak Н. Г., Flavell R. А., 1978. A method for the recovery of DNA from
