Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
поливинилпирролидона.
Буфер SSPE:
0,18 М NaCl 10 мМ (Nai,s)P04 1 мМ Na2-3flTA pH 7,0
Буфер SSPE 20X (на 1 л):
Ыаа-ЭДТА 7,4 г
NaOH (50 %) 8,8 мл
NaH2P04:H20 27,6 г
20 мМ 0,16 М 0,2 М
128
Раздел II. Методики
Обсуждение
Приведенные выше условия гибридизации разработаны для проведения
гибридизации с уникальной последовательностью бактериальной ДНК, когда на
фйльтр из геля элюировано в сумме около 1 мкг бактериальной ДНК- Если
вносится больше меченого зонда, то можно получить более сильный сигнал и
уменьшить время гибридизации. При использовании зонда, меченного 1251 для
получения низкого фона, гибридизацию надо вести в течение не более трех
часов. Неизвестно, почему при использовании меченной 1251 тРНКТуг при
длительной гибридизации получается высокий фон.
Если используемый зонд гомологичен ДНК высших животных, то в качестве
носителя нужно использовать не ДНК из спермы лосося, а какую-нибудь
другую, например бактериальную, ДНК. ДНК-носитель можно добавить прямо в
зонд, и тогда ее не нужно дополнительно добавлять при гибридизации.
Двухцепочечную ДНК можно денатурировать любым способом. Однако если
концентрация соли в ней выше, чем в буфере ТЕ, то мы рекомендуем
проводить денатурацию щелочью. Если зонд повторно используется после
длительной гибридизации в водном растворе, его можно денатурировать NaOH.
Добавьте к зонду 1/10 объема 1,5 М NaOH и через 10 мин добавьте 1/10
объема 1,5 М НС1. Если зонд в формамиде, то можно использовать тепловую
денатурацию. Зонд становится наполовину ренатурированным в соответствии с
таким уравнением:
Время, за которое происходит наполовину ренатурация в формамиде (в часах)
=0,05-(объем в мл) • (сложность зонда [kb])/(вес зоида [мкг]).
Так как одна из участвующих в гибридизации нуклеиновых кислот-партнеров
иммобилизована на твердой подложке, то трудно предсказать время,
необходимое для оптимальной или хотя бы достаточной для выявления
гибридизации. Лучше всего определить это время эмпирически.
Основная вариабильность результатов, получаемых при использовании этой
методики, определяется материалом и качеством фильтров. Обычно для
посадйи одноцепочечной ДНК используют нитроцеллюлозные фильтры фирм
Millipore (HAWP 00010) или Schleicher and Schuell (BA85). Однако от
партии к партии фильтров количество ДНК, связывающейся с ними, и уровень
фона варьируют.
Для того чтобы блокировать адсорбцию на фильтре меченой одноцепочечной
ДНК-зонда, достаточно присутствия ДСН и ДНК-носителя. Как правило, при
проведении обычной гибридизации на нитррцеллюлозных фильтрах не
обязательно использовать раствор BFP.
24. Радиоавтография S2P, связавшегося с фильтром
129
Методика 24
Радиоавтография 32Р, связавшегося с фильтром
1. Чтобы не загрязнить экраны и кассеты, заверните фильтр в пластиковую
пленку.
2. Завернутый фильтр положите на дно кассеты для рентгеновской пленки
размером 20X25 см (8ХЮ дюймов; кассеты 200024 Picker). Убедитесь, что
пластиковая пленка не торчит из кассеты.
3. К крышке кассеты прикрепите усиливающий экран [Dupont Cronex
Lightning-Plus ZC; 224-156 без зажимов, размер 8ХЮ дюймов (20X25 см)].
4. В темной комнате положите в кассету лист пленки Kodak X-Omat R или
Dupont Cronex 4 размером 8x10 дюймов (20X25 см). Чувствительность пленки
Cronex 4 в два-четыре раза ниже чувствительности пленки X-Omat R, однако
она имеет большее разрешение.
5. Перед тем как включить свет, закройте кассету и заприте ее. Заверните
кассету в алюминиевую фольгу и положите в морозильную камеру на -70°С.
6. Экспонируйте в течение от нескольких часов до нескольких дней.
7. Перед проявлением пленки выньте кассету из морозильной камеры. Прежде
чем развернуть алюминиевую фольгу, согрейте кассету до комнатной
температуры. Это необходимо для того, чтобы на пленке не произошло
конденсации и чтобы не повредился усиливающий экран.
8. В темной комнате снимите алюминиевую фольгу, откройте кассету и выньте
пленку.
9. Проявляйте в проявителе для рентгеновской пленки.
Окуните на 5 мин в готовый проявитель Kodak для рентгеновской пленки,
на 1 мин в останавливающий раствор (3%-ная уксусная кислота),
на 10 мин в быстрый фиксаж, на 15 мин в проточную воду.
Высушивайте пленку, повесив ее.
130
Раздел II. Методики
Методика 25
Выделение ДНК из агарозного геля
I. Использование стеклянных фильтров
1. Для разделения нужных фрагментов ДНК проведите электрофорез в
агарозном геле, используя трис-ацетатный или трис-фосфатный буфер (см.
методику 20) с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
2. Осветите длинноволновым УФ-светом лишь узкую полоску
: геля, чтобы УФ не повредил основной гель. Вырежьте из геля
кусок, содержащий полосу ДНК.
3. К этому кусочку геля добавьте такое количество буфера РРЕ [6 М NaC104,
50 мМ Nai,5H,,5P04 (pH 7), 10 мМ Ыа3-ЭДТА], чтобы конечная концентрация
NaC104 была ^5 М.
4. Такой препарат поместите на 37°С. Кусочек геля будет всплывать, так
что пробирку с препаратом нужно периодически переворачивать. Для
