Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
разорвите на четыре части). Намочите их буфером. Смачивайте и
накладывайте сразу по два листа. Пузырьки воздуха удаляйте, прокатывая
стеклянную палочку или пипетку. Буфер: для
переноса на нитроцеллюлозу используйте буфер SSPE
21. Перенос ДНК на нитроцеллюлозу или бумагу
117
20X (см. методику 23), для переноса на диазотированную бумагу - 0,1 М
ацетат натрия (pH 4,0).
2. На бумагу ЗММ наложите гель.
3. Смочите водой лист нитроцеллюлозного фильтра (Schleicher and Schuell
В85 или HAWP Millipore) или лист диазотированного фильтра, вырезанный по
размерам геля. Наложите его на гель так, чтобы между фильтром и гелем fie
оказалось пузырьков воздуха.
4. На нитроцеллюлозный фильтр наложите пять смоченных водой листов бумаги
ЗММ (вырезанных по размерам фильтра). Укладывайте их так, чтобы между
листами не было воздушных пузырьков.
5. Сверху бумаги ЗММ уложите стопку бумажных полотенец, нарезанных по
тому же размеру. Толщина стопки должна составлять около 6 см. Сверху
положите тонкую пластинку плексигласа, на которую поместите груз весом в
1 кг.
6. Проводите перенос в течение не менее 2 ч.
7. Переверните фильтр вместе с усохшим гелем, и мягким карандашом
отметьте на нем края геля и места лунок.
8. На 10 мин смочите нитроцеллюлозный фильтр буфером SSPE2X и затем
высушите в вакуумной печи при 80°С в течение 2 ч.
9. Проводите гибридизацию, как описано в методике 23.
Литература
Loh Е. Y. {личное сообщение).
Southern Е. М., 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis, J. Mo'i. Biol., 98, 503.
Wahl G. М., Stern M., Stark G. R., 1979. Efficient transfer of large DNA
fragments from agarose ge'ls to diazobenzyloxymethyl paper 'and rapid
hybridization by using dexiran sulfate, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 3683.
II. Перенос из бляшек фага X
1. Вырастите чашки LB с бляшками фага X так, чтобы на чашке было 102-105
бляшек. Используйте сухие чашки или чашки, разлитые за 2 дня до опыта.
2. Чтобы агар стал твердым, охладите чашки с бляшками при 4°С. Держите их
при этой температуре, от примерно 15 мин до нескольких часов.
3. На газон наложите сухой нитроцеллюлозный фильтр диаметром 82.мм
(Schleicher and Schuell ВА85 или HAWP Millipore) . Следите, чтобы между
агаром и фильтром не оказалось пузырьков воздуха.
118
Раздел II. Методики
4. Адсорбцию проводите в течение 1-2Q мин.
5. а. Во время этой адсорбции сделайте отметки на фильтре
и на чашке, чтобы фиксировать их взаимную ориентацию. Для этого можно
проколоть каждый фильтр (в то время, когда он находится на чашке) по краю
в трех местах шприцем с иглой номер 25 и нанести капли черных
нерастворимых в воде чертежных чернил, в которые добавлена
денатурированная немеченая ДНК-зонд в концентрации 1 мкг/мл. Объем
наносимых капель составляет около 10 мкл. Чашки нужно помечать
несимметрично и так, чтобы их можно было размечать,
б. Чтобы фиксировать ориентацию фильтра относительно чашки, нужно
добавить на чашку с бля!иками такой фаг, который можно на чашке
идентифицировать и который будет гибридизоваться с зондом. Перед тем как
поставить чашку инкубироваться, капните на газон около 10 частиц фага
Xgt5-lac5, pBR322. Можно также добавить 10- 20 частиц фага Agt5-/ac5,
pBR322 при высеве 102-105 частиц испытываемого фага. В этих случаях высев
проводят в верхнем агаре с Xgal (добавляется 40 мкл_раствора Xgal в ДМСО
с концентрацией 40 мг/мл, который хранят при -20°С).
6. Осторожно снимите фильтр с чашки.
7. Погрузите фильтр (или сразу всю партию фильтров) в 0,5 Al NaOH и 1,5 М
NaCl на время от 20 с до 5 мин.
8. Фильтр (или сразу всю партию) погрузите в 0,5 М трис (pH 7,5) и 1,5 М
NaCl на время от 20 с до 5 мин.
9. Сполосните в буфере SSPE2X (см. методику 23).
10. Промокните и отожгите в вакууме при 80°С в течение 1,5- 2 ч.
11. Гибридизацию проводите, как указано в методике 23.
12. После того как проявите рентгеновскую пленку, наложите ее на
обернутый в пластик фильтр. Перенесите на пленку те пометки, которые были
сделаны на фильтре, чтобы фиксировать ориентацию и номер.
13. Наложите маркированную рентгеновскую пленку на исходную чашку.
Выявите бляшки, дающие гибридизацию.
Обсуждение
В бляшке фага X содержится значительное количество ДНК (как в частицах
фага, так и в виде свободной ДНК). При контакте с нитроцеллюлозным
фильтром часть этой ДНК необратимо адсорбируется на нем. После этого
адсорбированную ДНК можно денатурировать и проводить с ней гибридизацию,
не вызывая ее смещения. В результате удается локализовать те бляшки, в
которых есть последовательность ДНК, гибридизующаяся
21. Перенос ДНК на нитроцеллюлозу или бумагу
119
с радиоактивным зондом. С каждой чашки можно сделать по крайней мере семь
таких отпечатков.
1. При использовании чашек LB пятна гибридизации получаются сильнее, чем
при использовании чашек для фага X, хотя бляшки на первых и оказываются
мельче. Допустимое число бляшек на чашку зависит от размера бляшек. Если
