Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
количеством буфера 50 мМ КР04 и 1 мМ ДТТ. Элюируйте градиентом
концентрации буфера 50-250 мМ (с 1 мМ ДТТ). Элюируйте объемом, равным 7-
8 объемам колонки. Объедините пиковые фракции (пик белка в середине
градиента) и осадите сульфатом аммония (85% насыщения, или 0,6 г/мл).
Осадок ресуспендируйте в таком объеме 100 мМ КР04 (pH 7,0), чтобы
концентрация белка составила 10 мг/мл.
B. Хроматография на сефадексе G-100
Набейте колонку с сефадексом G-100 (объем сефадекса в колонке должен быть
^25 объемов наносимого образца). Уравновесьте сефадекс буфером для
колонки (100 мМ КР04 pH 7,0). Нанесите образец и следом пустите буфер для
колонки. Объедините пиковые фракции. Пик должен элюиро-
29. Выделение ферментов из Хс1857-клеток
139
ваться сразу же после исключенного объема. При желании можно
сконцентрировать препарат, как было описано выше. Препараты храните
замороженными при -70°С в том виде, как они были элюированы с последней
колонки (Jovin et аГ., 1969). Небольшой объем можно хранить примерно в
течение года при -20°С, добавив равный объем глицерина.
Г. Определение активности
Проба для определения активности содержит 50 мМ. трис (pH 7,5), 10 мМ
MgCl2 и 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл активированной (обработанной ультразвуком)
ДНК тимуса теленка или спермы лосося, по 20 мкМ каждого dNTP и около 100
000 имп./мин a-32P-dCTP или dGTP. Одна единица фермента соответствует
включению примерно 10% метки в кислотонерастворимый материал за 3 мин при
37°С в пробе объемом 100 мкл. (1 ед. активности дает включение 10 моль за
30 мин, с поправкой на нуклеотидный состав.) При таком способе
определения активности чистый фермент обладает удельной активностью около
2500 ед./мг.
Литература
/ovin Т. М., Englund Р. Т., Bertsch L. L., 1969. Enzymatic synthesis of
deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 244, 2996.
Richardson С. C" Schildkraui C. L., Vashen Aposhian H., Kornberg A.,
1964. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 39,
222.
III. ДНК-лигаза фага T4 из лизата клеток Е. coli El 150 (см. список
штаммов)
А. Фракционирование
-К надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония в концентрации 5% от
насыщения, добавьте сухой сульфат аммония (0,33 г/мл). Помешивайте на
холоду в течение 1ч, центрифугируйте 30 мин при 10 000 об/мин в роторе
JA-14. Ресуспендируйте осадок в буфере, содержащем 25 мМ трис (pH 7,2),
0,3 М NaCl и 1 мМ ДТТ. Разведите таким образом, чтобы ионная сила
соответствовала 0,3 М NaCl и пропустите через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой
DE-52 (0,5-1,0 мл смолы на 1 г клеток) в этом же буфере.
Б. Фракционирование на Р-11 и DE-52
Диализуйте препарат против буфера, содержащего 25 мМ трис (pH 7,2) и 1 мМ
ДТТ. Нанесите образец на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 (0,5-1,0 мл смолы
на 1 г клеток), уравновешенной этим же буфером. Промойте ко-
140
Раздел II. Методики
лонку таким количеством этого буфера, который равен двум объемам колонки.
Промойте буфером + 0,15 М NaCl в количестве, равном двум объемам колонки.
Элюируйте буфером с 0,75 М NaCl. Белок, элюированный с колонки,
диализуйте против буфера, содержащего 25 мМ трис (pH 7,2) и 1 мМ ДТТ.
Выпавший при диализе белковый осадок отцентрифу-гируйте и отбросьте.
Препарат нанесите на колонку с DE-52 (0,5 мл смолы на 1 г клеток),
промойте буфером 25 мМ трис (pH 7,2) и 1 мМ ДТТ в количестве, равном двум
объемам колонки. Элюируйте этим же буфером плюс 0,3 М NaCl.
В. Хроматография на гидроксилапатите
Элюат с DE-52 прямо наносите на колонку с гидроксил-апатитом (0,5 мл
смолы на 1 мг белка), уравновешенным буфером, содержащим 25 мМ трис (pH
7,2), 1 мМ ДТТ и 0,3 М NaCl. Промойте этим буфером в количестве, равном
двум объемам колонки. Элюируйте градиентом концентрации сульфата аммония
0-0,5 М в буфере с 0,3 М NaCl. Ли-газа (>95% чистоты) выходит в
единственном основном белковом пике.
Г. Определение активности
Удобный, но отнюдь не количественный метод определения активности лигазы
состоит в том, что замыкаются кольца небольшие кольцевые молекулы ДНК,
расщепленные такой рестриктирующей эндонуклеазой, которая приводит к
образованию липких концов и которая свободна от примеси фосфатазы и
экзонуклеазы. Более традиционные методы тестирования активности описаны в
приведенных ниже работах (Weiss et al., 1968; Modrich and Lehman, 1970):
По-видимому, с помощью большинства методов нельзя правильно определить
активность лигазы до тех пор, пока препарат не будет первый раз очищен на
DE-52. После очистку на Р-11 активность препарата можно правильно
определить уже любым способом.
Литература
Modrich P., Lehman I. R., 1970. Enzymaiic joining of polynucleotides, J.
Biol. Chem., 245, 3626.
Weiss B., Jasquemin-Sablan A., Live T. R., Fareed G. C., Richardson C. C"
1968. Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, J. Biol.
Chem., 243, 4543.
Раздел III
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1
Среды, концентрации лекарственных препаратов, пищевые добавки
I. Среды
А. Среда LB (Луриа-Бертани)
