Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
температуре.
7. Низкие значения pH вызывают депуринизацию, но этот процесс
характеризуется высокой энергией активации.
8. Бромистый этидий вызывает фотоокисление ДНК при облучении ее видимым
светом в присутствии молекулярного кислорода. Он хорошо захватывает
свободные радикалы.
9. Фенол. Продукты его окисления могут вызывать разрывы фосфодиэфирных
связей.
10. Эфир. Перекиси вызывают, по-видимому, разрывы фосфодиэфирных связей.
11. Формамид. Большинство водных растворов формамида со временем
закисляется (до pH 5). Поскольку процесс катализируется щелочью, то лучше
забуферить раствор формамида около pH 7 с помощью фосфата или PIPES. Если
РНК находится в формамиде дольше нескольких дней, то в ней обнаруживается
некоторое количество разрывов фосфодиэфирных связей.
12. Этанол. В отсутствие тяжелых металлов этанол не вызывает повреждений
ДНК-
13. Нуклеазы. У людей на кожном покрове присутствуют нукле-азы. Поэтому
старайтесь, чтобы пальцы не приходили в прямой или опосредованный контакт
с нуклеиновыми кислотами. В большинстве своем ДНКазы не очень стабильны.
Однако многие РНКазы чрезвычайно устойчивы. РНКаза
3. Хранение бактерий, фагов и ДНК
151
может сорбироваться на стекле или пластике и оставаться при этом
активной.
14. 5°С. Это одна из наиболее подходящих для хранения ДНК температур.
15. -20°С. При этой температуре происходит интенсивное образование одно-
и двухцепочечных разрывов. Соль в растворах ДНК вымораживается, а точка
замерзания насыщенного раствора соли примерно соответствует тем
температурам, которые получаются в большинстве морозильных камер при их
циклической работе. В результате ДНК подвергается многократным циклам
замораживания - оттаивания.
16. -70°С. Это, по-видимому, лучшая температура для длительного хранения.
Помните, однако, что в замороженном состоянии повреждающее действие
свободных радикалов может быть гораздо выше.
Хранить ДНК в течение длительного времени лучше всего в растворах с
высокой концентрацией соли (ТзП М), высокой концентрацией Иаг-ЭДТА (^10
мМ) при pH 8,5 (трис-буфер).
Очень хорошо хранить ДНК в растворе CsCl с бромистым этидием, плотность
которого соответствует плавучей плотности ДНК, при 5°С в темноте
(завернув сосуд в алюминиевую фольгу). При этих условиях за год
происходит разрыв примерно одной фосфодиэфирной связи на 200 kb ДНК.
ДНК фага К лучше сохраняется в частицах фага, чем в виде очищенной ДНК- В
фаговых частицах в растворе CsCl с плотностью, еоответствующей плавучей
плотности фага, ДНК может храниться в течение 5 лет, и при этом не
выявляется каких-либо ее повреждений (менее одного разрыва на 200 kb).
Приложение 4
Буферы и растворы
I. Буферы
Буфер pKa (20°C) ЛрХа/°С Мол. масса Молярность насыщенного раствора
при 0°С
PIPES 6,80 - 0,0085 342 1,4
MOPS 7,20 - 0,006 209 3,0
TES 7,50 - 0,020 229 2,6
HEPES 7,55 - 0,014 238 2,2
HEPPS 8,00 - 0,007 252 2,5
Трис 8,30 - 0,031 121 2,4
152
Раздел III. Приложения
Литература
Good. N. Е., Winget G. D., Winter W.,. Connolly T. N.. Izawa S., Singh К.
М. M:, 1966. Hydrogen ion buffers for biological research, Biochemistry,
5, 467.
pH Количество трис, моль
Трис-НС1 Трис-ОН
7,2 0,889 0,111
7,3 0,867 0,133
7,4 0,837 0,163
7,5 0,804 0,196
7,6 0,767 0,233
7,7 0,724 0,276
7,8 0,673 0,327
7,9 0,618 0,382
8,0 0,562 0,438
8,1 0,509 0,491
8,2 0,448 0,552
8,3 0,389 0,611
8,4 0,334 0,666
8,5 0,280 0,720
8,6 0,232 0,768
8,7 0,190 0,810
8,8 0,156 0,844
8,9 0,122 0,878
9,0 0,096 0,904
pH буферов (при использовании эквимолярных количеств кис лотной и
основной форм):
НС1/КС1= 1,4 Глицин-НС1/'глицин = 2,5
Муравьиная кислота/муравьинокислый натрий = 3,7 Лимонная кислота/цитрат
натрия = 4,6 Уксусная кислота/ацетат натрия = 4,7 Какодиловая
кислота/какодилат натрия = 6,2 KH2P04/Na2HP04 = 6,9 NH4C1/NH40H = 9,4
Глицин/глицинат натрия = 9,7 NaHC03/Na2C03= 10,4 pH стандартных растворов
при 25°С:
0,1 М НС1= 1,10
Насыщенный раствор КН-тартрата = 3,56 25 мМ КН2Р04 + 25 мМ Na2HP04 = 6,86
4. Буферы и растворы
153
0,01 М бура = 9,18
Насыщенный раствор Са (ОН) 2 = 12,45 0,1 М NaOH= 12,88
II. Концентрации растворов
Растворы CsCl
Зависимость плотности раствора CsCl от показателя преломления: р < 1,38
р25 = 10,2402-^25- 12,6483
р > 1,37 р2В= 10,8601-^5- 13,4974
Зависимость молярности раствора CsCl от его плотности
М = 8 (р25 - 1)
Насыщенный раствор CsCl при 25°С = 1,92 г/мл, или 7,36 М Плотность белка
s 1,3 Плотность углеводов а; 1,5 - 2,0 Растворы нуклеозидтрифосфатов
ATP-Na2-2HaO 587,2 г/моль dATP-(NH4)3-2H20 578,3 г/моль
GTP-Na2-2H20 603,2 г/моль dGTP-(NH4)3-1,5Н20 585,3 г/моль
UTP-Na3-4H20 622,2 г/моль dTTP-Li3 500,0 г/моль
CTP-Na2-4H20 599,2 г/моль dCTP-Ri3-2H20 485,1 г/моль
АТР А259 = 1,54-10* М"* см-1 при pH 7
GTP А253 = 1,37-10* М-1 см-1 при pH 7
UTP А262 = 1,00-10* М-1 см-1 при pH 7
СТР А271 = 9,1 • 103 М-1 см-1 прн pH 7
Перед хранением основные растворы следует нейтрализовать до pH 7-8.
Растворы тринатриевых солей имеют pH около 7. Растворы нуклеиновых кислот
