Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Интактные BPV-1-плазмиды можно «спасти» (наработать и выделить) в Е. coli путем трансфекции бактериальных клеток низкомолекулярной ДНК, выделенной из трансформированных клеток. Соответствующая методика приведена в табл. 5. Выделенные из Е. coli плазмиды имеют ту же структуру и такие же
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
501
трансформирующие свойства, что и оригинальные ДНК [24, 25]. Это наблюдение послужило отправной точкой в разработке векторов на базе BPV-1. Способность BPV-1-плазмид существовать в форме автономных репликонов как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, обусловливает возможность их применения в качестве челночных векторов для генетического переноса между клетками млекопитающих и бактериальными клетками. Такие векторы уже применялись при исследовании особенностей регуляции функционирования генов (см. ниже) и без сомнения окажутся весьма полезными для выделения специфических генов. Интересующие гены можно отбирать, руководствуясь фенотипическими изменениями, наблюдаемыми в клетках млекопитающих, и затем нарабатывать в препаративных количествах в Е. coli, что обеспечит возможность их детального изучения.
3.2. Гибридные плазмиды, экспрессирующие селективные маркеры
Один из главных недостатков векторных систем на основе BPV-1 заключается в том, что идентификацию трансформантов проводят на основе морфологии контактно ингибированных клеток. Это ограничивает круг возможных хозяев для BPV-1 только теми клетками, которые способны формировать фокусы. Введение в плазмиды на основе BPV-1 доминантных селективных маркеров позволило расширить выбор хозяев для этих векторов за счет клеток, которые не экспрессируют трансформированный фенотип, однако способны поддерживать репликацию BPV-1-зписом.
Биохимические маркеры, используемые в настоящее время в векторах на базе BPV-1, включают продукты генов тимидин-киназы (tk) вируса простого герпеса типа I (HSV-1), ксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (gpt) Е. coli и аминоглико-зид-З'—фосфотрансферазы (aph, ген устойчивости к неомицину) из транспозона Тп 5.
3.2.1. Гибридные плазмиды BPV-tk
К ним относятся плазмиды, содержащие ген tk вируса герпеса, состыкованный с 69Т-фрагментом BPV-1 (рис. 3). Они способны трансформировать ряд клеточных линий ТК~, сообщая им фенотип 77С+: мышиные L-клетки, ВНК21, крысиные клетки Rat2 и человеческие клетки 143 [14,33J. Плазмиды pMLBPVTK2 и pMLBPVTK4 трансформируют крысиные клетки Rat2 и человеческие 143 эффективнее, чем родительская плазмида pMLTK (табл. 6), причем это более заметно на крысиных клетках. По-
502
Глава 8
Рис. 3. Рекомбинантные плазмиды BPV-1-tk. A. pML-BPV-tk получена путем введения .Ва/лШ-фрагмента (3,4 т.п.н.), содержащего ген tk HSV-1 [28] в BamHl-сайт pML-BPV 69Т. Показаны две возможные ориентации гена tk. В pML-BPV-tk4 направление транскрипции гена tk совпадает с направлением транскрипции 69Т-фрагмента, а в pML-BPV-tk2 они противоположны. Б. pBPV-tk получена путем лигирования 69Т-фрагмента с большим ЯтсПН-ВатШ-фрагментом плазмиды pAGO — производной pBR322, содержащей Pvull-фрагмент (2 т.п.н.), в состав которого входит ген tk HSV-1 [29]. Поскольку для клонирования использовали разноименные сайты (Hitic1III и ВатШ), взаимная ориентация лигированных фрагментов была предопределена, направление транскрипции гена tk и 69Т-фрагмента совпадает. Щ 69Т-фрагмент BPV-1; ------,
плазмидная ДНК.
вышение эффективности трансформации обусловлено присутствием энхансера BPV-1 [12, 14] и не зависит от его расположения и ориентации относительно направления транскрипции гена tk. Такая же ситуация имеет место при трансформации плазмидой pBPV-TK клеток хомяка ВНК21, однако для мышиных L-клеток этот вывод несправедлив (табл. 6). (Удивительно, ведь сам по себе энхансер BPV увеличивает эффективность трансформации L-клеток геном tk приблизительно в 7 раз, даже будучи введен за 800 нуклеотидов до промотора гена tk [12]). Причины описанных различий неясны; возможно, они связаны с конкретными особенностями той или иной плазмиды.
В трансформированных клетках основная масса рекомбинантной плазмидной ДНК интегрируется в клеточный геном и лишь небольшая ее часть присутствует в форме эписом. Экстра-хромосомные плазмиды можно «спасти» и наработать в бактериях и трансформировать ими клетки с той же эффективностью, что и исходными плазмидами [33]. Однако, в связи с тем, что только очень малая часть этих плазмид сохраняется в виде экстрахромосомных копий, их вряд ли можно рассматривать как потенциальные челночные векторы.
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования_______________503
Таблица 6. Эффективность трансформации клеток плазмидами BPV-tk
Плазмида Rat 21' Человече Мышиные ВНК213) Источник
ские клетки L-клетки3) данных
1432)
pMLTK 160 51 [141
pMLBPVTK2 1300 131 [14]
