Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. Индуцибельные гены. BPV-векторы использовали также для изучения экспрессии генов, регулируемых специфическими индукторами. В случае гена гормона роста крысы, клонированного в составе pGP (рис. 8), оказалось, что его экспрессия в трансформированных мышиных клетках носит конститутивный характер и не реагирует на глюкокортикоиды [48]. Потеря ин-дуцибельности может быть связана с неправильной инициацией транскрипции гена, поскольку синтезируемая трансформантами мРНК оказывается примерно на 200 нуклеотидов длиннее, чем аутентичная мРНК GH. В плазмиде pBPVMG (рис. 8 Б) человеческий мини-ген GH состыкован с промотором металлотионеи-нового гена [49]. Обработка трансформированных pBPVMG клеток кадмием приводила как к повышению уровня гибридной мРНК МТ-GH (от 2 до 7 раз), так и к увеличению количества секретируемого GH (в 2 раза). В то же время, при обработке дексаметазоном такого эффекта не было. Следовательно, можно предположить, что регуляция металлотионеинового гена металлами и гормонами осуществляется посредством различных механизмов и что, по крайней мере, один из них не работает в паре с клонированными регуляторными последовательностями. Когда клетки, трансформированные BPV-рекомбинантами, содержащими длинный концевой повтор (LTR) вируса рака молочной железы мышей (MMTV) (рис. 10), выращивали в присутствии дексаметазона, уровень мРНК v-ras, транскрибируемой под контролем глюкокортикоид-зависимого промотора, возрастал в 30—100 раз по сравнению с неиндуцированными клетками. Это подтверждает сделанный на основании предшествующих наблюдений вывод о том, что длинный концевой повтор MMTV служит мишенью для глюкокортикоидной индукции, и эта роль LTR сохраняется даже в том случае, когда он находится в составе эписомы (будучи отделен от возможных контролирующих клеточных последовательностей, фланкирующих его в геноме).
Клетки, трансформированные рекомбинантными плазмидами BPV-IF [52, 53] (рис. 9), конститутивно продуцируют человеческий ^-интерферон и отвечают на индукцию как инактивированным вирусом ньюкаслской болезни, так и poly(I)-poly(C).
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
517
Индукция приводит к 32-кратному повышению уровня мРНК (5-IF человека, а количество продуцируемого человеческого ?5-ин-терферона увеличивается в 120 раз. По-видимому, конститутивные транскрипты инициируются неправильно. Не так давно были локализованы и идентифицированы два контролирующих элемента, которые управляют экспрессией гена ^-интерферона человека [54]. Один из них расположен в области —77 —19 относительно cap-сайта и определяет как конститутивную, так и индуцированную экспрессию JMF. Другой элемент находится в области —210 —107; при утрате этого элемента (в результате делеции) уровень конститутивных транскриптов возрастал приблизительно в 10 раз, в то время как количество индуцированных мРНК [J-IF оставалось без изменения.
4. Заключение
Несмотря на успешное использование ДНК BPV-1 в качестве эукариотического вектора для молекулярного клонирования, некоторые его биологические свойства остаются неизученными.
ДНК BPV-1 или его векторных производных присутствует в трансформированных клетках в форме множественных эпи-сом; количество их копий варьирует в зависимости от типа клеток от 20 до 300. В то же время, в клетках данной линии количество эписом сохраняется постоянным на протяжении длительного времени. Поскольку минихромосомы BPV не содержат центромер, их сегрегация и распределение по дочерним клеткам, вероятнее всего, происходит случайным образом и, следовательно, количество их копий в клетке — величина случайная. Однако факторы (если таковые имеются), определяющие представленность эписом в данной клетке и способствующие поддержанию постоянного среднего числа копий в данной клеточной линии, неизвестны. Кроме того неизвестно, реплицируется ли ДНК BPV на какой-то определенной стадии клеточного цикла, или же ее синтез может происходить в любой момент.
Неясно также, почему для осуществления эффективной клеточной трансформации необходимо отделить 69Т-фрагмент от вектора (это условие необязательно только в случае плазмиды рАТ153) и в то же время введение в рекомбинантные плазмиды фрагментов ^-глобинового гена человека или гена гормона роста крысы обусловливает трансформирующую способность этих плазмид в интактной форме.
Когда в BPV-векторы вводят доминантные маркеры и трансформантов отбирают, например, по экспрессии генов tk или gpt, BPV-плазмиды обнаруживаются в этих клетках в интегрированной форме. В то же время, в клетках, отобранных по устойчивости к неомицину, они существуют в виде множественных эписом.
518
Глава 8
Можно ли из этого факта сделать вывод, что для успешной экспрессии генов tk и gpt необходимо присутствие рядом с ними контролирующих клеточных элементов? Ответ на данный вопрос может дать анализ клеточных последовательностей в участках интеграции рекомбинантных плазмид.
Еще одним загадочным свойством BPV-плазмид является их способность приобретать новые последовательности ДНК; особенно часто это наблюдается при использовании 69Т-фрагмента. Можно предположить, что для эффективной репликации плазмиды необходим определенный минимальный ее размер. С другой стороны, загадочная способность приобретать новые последовательности может быть и следствием происходящих в клетке рекомбинационных событий.
