Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Еще более непонятен тот факт, что весьма близкие в структурном отношении рекомбинантные плазмиды ведут себя по-разному. Наиболее ярким примером могут служить pCGBPV7 и pCGBPV9: первая интегрируется в геном трансформированной клетки, а вторая существует как автономный репликон. Разница между двумя плазмидами заключается в различной взаимной ориентации составляющих их структурных элементов. В первом случае транскрипция последовательностей Тп5 и BPV однонаправленна, тогда как во втором случае она происходит в разных направлениях. Поскольку структура мРНК, транскрибируемых на матрицах этих плазмид неизвестна, вопрос о том, влияет ли характер транскрипции (и если да, то каким образом) на их внутриклеточное поведение, остается открытым.
Несмотря на отмеченные трудности, именно с помощью векторов BPV были клонированы многие эукариотические гены и однозначно идентифицированы регуляторные элементы индуци-бельных генов (в частности, речь идет об изящной работе, посвященной гену ^-интерферона человека). В дальнейшем можно планировать изучение взаимодействий этих элементов с контролирующими факторами, что позволит расширить и углубить наши представления о механизмах индукции генов.
Правильная экспрессия генов, клонированных в векторах на базе BPV, делает эту векторную систему применимой не только в области «чистой» науки, но и в сфере прикладных исследований. Так, введение в клетки млекопитающих нескольких копий гена поверхностного антигена HBV и осуществление их правильной транскрипции и последующей модификации синтезируемых продуктов послужило бы важным вкладом в дело создания противовирусной вакцины.
Как мы уже говорили, не все рекомбинантные плазмиды присутствуют в клетке в виде эписом — некоторые из них интегрируются в геном, что, по-видимому, связано с их крупными размерами (например, HLA-плазмиды). Способность большинства BPV-reeo-плазмид существовать в форме эписом и обеспе-
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
519
чивать челночную векторную связь между эукариотическими и прокариотическими клетками делает их особенно удобными в практической работе. Можно получить неомицинустойчивые рекомбинантные плазмиды, в которых присутствуют только BPV-детерминанты, необходимые для автономной плазмидной репликации. Такие рекомбинантные конструкции имеют меньший размер и поэтому способны включать в свой состав более крупные фрагменты ДНК; их можно эффективно размножать в клетках, селектируемых по устойчивости к G418.
Дальнейшее углубление наших знаний о функциональной организации генома BPV несомненно будет способствовать не только исследованиям в области вирусологии, но и разработке новых эукариотических векторных систем с улучшенными характеристиками.
Благодарности
Мы благодарим Д. ДиМайо, предоставившего в наше распоряжение неопубликованные данные, К. Смита, который взял на себя труд критически просмотреть рукопись, Р. Форбес, оказавшую нам неоценимую секретарскую помощь, и Д. Таллака, выполнившего фотографические работы. Собственные научные изыскания автора настоящей статьи проводились под эгидой Совета по раковым исследованиям (GRC).
Литература
1. Rigby P. W. J. In: Genetic Engineering, Williamson R. (ed.), Academic Press, Vol. 3, p. 83 (1982).
2. Lancaster W. D., Olson C. Microbiological Reviews, 46, 191 (1982).
3. Pfister H. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 99, 112 (1984).
4. Chen E. Y., Howley P. М., Levinson A. D., Seeburg P. H. Nature, 299, 529
(1982).
5. Lancaster W. D. J. Virol., 32, 684 (1979).
6. Campo M. S., Moar M. H„ Laird H. М., Jarrett W. F. H. Virology, 113, 213 (1981).
7. Morgan D. M„ Murphy М. E., Abraham J. М., Meinke W. J. J Gen. Virol, 56,213 (1981).
8. Amtmann E„ Sauer G. J. Virol., 43, 59 (1982).
9. Heilman C. A., Engel L. W., Lowy D. R.t Howley P. M. Virology, 119,
22 (1982).
10. Engel L. W., Heilman C. A., Howley P. M. J. Virol., 47, 516 (1983).
11. Rosl F„ Waldek W., Sauer G. J. Virol., 46, 567 (1983).
12. Campo M. S., Spandidos D. A., Lang J., Wilkie N. M. Nature 303, 77
(1983).
13. Nakabayashi Y., Chattopadhyay S. K., Lowy D. R. Proc. Natl Acad. Sci USA, 80, 5832 (1983).
14. Lusky М., Berg L., Weiher H„ Botchan M. Mol. Cell Biol., 3, 1108 (1983).
15. Lowy D. R., Dvoretzky I., Shober R., Law M. F., Engel L., Howleu P M.
Nature, 287, 72 (1980).
16. Maniatis Т., Fritsch E, F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory
520
Глава 8
Manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. [Имеется перевод: Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984.]
17. Bolivar F., Rodriguez RGreen P. J., Betlach М., Heyneker H. L„ Boyer H. W„ Crosa J., Falkow S. Gene, 2, 95 (1977).
18. Twigg A. J., Sherratt D. Nature, 283, 216 (1980).
19. Soberon X., Covarrubias L., Bolivar F. Gene, 9, 287 (1980).
20. Lusky М., Botchan M. Nature, 293, 79 (1981).
