Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3.3.3. Интеграция в хозяйский геном
Большинство BPV-рекомбинантов присутствует в трансформированных клетках в виде множественных кольцевых эписом; их число варьирует от 100 до 200 копий на клетку в различных клеточных линиях. pBPV-p и pGP сохранили в своем составе плазмидные последовательности, благодаря чему их можно «спасать» и нарабатывать в Е. coli в форме интактных мономерных эписом [46, 48]. В то же время некоторые другие гибридные плазмиды подвергаются в клетке реорганизации и (или) интегрируются в хозяйский геном.
Так например, BPV69T-IFNjil и BPV-IF, которые несут ген ^-интерферона человека (рис. 9), несмотря на то, что размножаются как эписомы, имеют в своем составе чужеродные последовательности ДНК, заимствованные либо из хозяйского генома, либо из ДНК, используемой в качестве носителя, и в некоторых линиях клеток присутствуют исключительно в мультимерной форме [52, 53]. Точно так же в рМ2 6V4, которая содержит ген sAg HBV (см. рис. 12), наблюдаются различного рода перестройки, включая делеции и инсерции [57].
Плазмиды рМ20 и рМ21 (рис. 10 В), в противоположность другим представителям этих же серий (см. разд. 3.3.4), обнаруживаются почти всегда в виде интегрированных копий, претерпевших различные перестройки; количество копий этих плазмид в клетке ниже, чем количество копий сестринских плазмид [55]. Причины отмеченных различий неясны; возможно, они связаны с присутствием 72-нуклеотидного энхансера вируса саркомы мышей Харви (H-MSV).
Плазмида pBPV-^HLA (рис. 11) в трансформированных клетках также существует в виде высокомолекулярных структур, образованных интегрированными тандемно повторяющимися копиями. Интеграция может быть обусловлена большим размером плазмиды, может происходить вследствие гомологичной рекомбинации с мышиными генами Н2 или благодаря каким-то другим неизвестным факторам.
33-196
514
Глава 8
Рис. 11. Ген тяжелой цепи HLA человека в BPV-fi-глобиновом векторе. #mdl II-фрагмент (8,5 т.п.н.), содержащий ген тяжелой цепи HLA человека, лигирован с pBPV-HlI, обработанной рестриктазой Hindlll. Полученная плаз-,'мида была подвергнута неполному гидролизу tfindlll; полноразмерные линейные молекулы лигировали с Hind 111-фрагментом (7,6 т.п.н.) fi-глобинового кластера человека. Одна из конструкций получила обозначение pBPV-fl HLA-1 (А); в ней направление транскрипции гена HLA совпадает с таковым g-глоби-нового гена, но противоположно по отношению к ДНК BPV. В другой конструкции — pBPV-Р HLA-3 (Б), транскрипционная ориентация HLA противоположна ориентации как g-глобинового гена, так и ДНК BPV. Ген 0-глобина человека был введен в состав рекомбинантной конструкции BPV-HLA для стабилизации BPV-плазмиды ([46]; см. разд. 3.2.2). Эффективность трансформации pBPV-^HLA составляет -150 фокусов/мкг ДНК- ¦, BPV69T; ?, ген тяжелой цепи HLA; —, последовательность ^-глобинового гена;-------------, pBR322.
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
515
АЛЛ HBsAg
Рис. 12. Ген поверхностного антигена HBV в BPV-плазмиде. BglII-фрагмент ДНК HBV (2,7т.п.н.), содержащий ген поверхностного антигена (sAg) и его предполагаемую промоторную последовательность [58] ввели в BamHI-сайт pML2; в ЯшШ1-сайт этой же плазмиды ввели линеаризованную полноразмерную ДНК BPV-1. В полученной рекомбинантной плазмиде pM26V4 направление транскрипции гена sAg такое же, как ДНК BPV. Перед трансфекцией плазмидные последовательности удаляли с помощью рестриктаз Sail и Pvull. Эффективность трансформации составляла 10 фокусов/мкг ДНК. ¦, ДНК
BPV;-----, pML2.
3.3.4. Экспрессия клонированных генов
Все эукариотические гены, клонированные в векторах на базе BPV, находятся под контролем либо своих собственных транскрипционных промоторов, либо гетерологичных регулярных элементов. Ни один из клонированных генов не контролируется промоторными последовательностями BPV.
1. Неиндуцибельные гены. Гены препроинсулина крысы, 0-глобина человека, гены HLA и ген sAg HBV надлежащим образом транскрибируются и экспрессируются в клетках, трансформированных соответствующими BPV-рекомбинантами. Инсулиновая мРНК правильно транслируется в препроинсулин, который в свою очередь процессируется с образованием проинсулина. Проинсулин выходит в среду культивирования. В то же время очередная стадия созревания, а именно превращение проинсулина в инсулин, в клетках С127 не происходит — вероятно, в связи с отсутствием необходимых ферментов [43]. ^-Глобино-вая мРНК правильно сплайсируется и полиаденилируется, однако ^-глобин в трансформированных клетках не идентифицируется. Не исключено, что это связано с нестабильностью глобино-вых белков в неэритроидных клетках [46]. Ген HLA также эффективно транскрибируется; в этом случае происходит синтез
33*
516
Глава 8
больших количеств тяжелых цепей, и какая-то часть специфического белка человека обнаруживается на клеточной поверхности в виде ассоциатов с мышиным ^-микроглобулином [56]. Несмотря на обширные перестройки, обнаруженные в гибридной ДНК BPV-HBV, ген sAg экспрессируется правильно [57]. Трансформированные клетки продуцируют и секретируют HBsAg-частицы, неотличимые от 22нм-частиц, которые присутствуют в сыворотке больных, пораженных HBV. Это означает, что в данной системе белок надлежащим образом синтезируется, гликозилируется, собирается и секретируется. Отметим, что структура мРНК sAg пока остается неизученной.
