Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 240

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 234 235 236 237 238 239 < 240 > 241 242 243 244 245 246 .. 253 >> Следующая

(см. текст).
Л/V интроны GH
Рис. 8. Гены гормона роста в векторах на основе вируса бычьей папилломы (BPV-векторах). A. pGP получен путем лигирования ?соШ-#тс1Ш-фрагмента ДНК крысы (5,8 т.п.н.), содержащего ген гормона роста [47], с большим ЕсоШ-НМШ-фратентом плазмиды pBR327 и последующего введения фрагмента BPV69T между сайтами Hindlll и ВатШ. Эффективность трансформации составляет —25 фокусов/мкг ДНК- ¦, BPV69T; --------¦, pBR327; —, ген
гормона роста крысы. Б. BPVMG получена с использованием BemHI-фрагмен-та, содержащего часть геномной последовательности и часть кДНК гена гормона роста человека [50]. Этот фрагмент ввели в сайт BgllI 5'-нетрансли-руемой зоны гена мегаллотионеина мыши (МТ) [51]. Гибридный ген MT-GH был выделен в составе ЯшсИН-фрагмента и затем введен в ЯймНН-сайт pdBPV69T. Плазмидные последовательности удалили с помощью рестриктазы ВатШ, после чего сегмент BPV-MT-GH был рециклизован путем лигирования и использован для трансформации клеток С127. Таким образом, плазмида BPVMG кроме 69Т-фрагмента содержит 5'-фланкирующие последовательности гена МТ (1,6 т.п.н.), 5'-нетранслируемую последовательность МТ (68п.н.), первый экзон гена GH (70 п.н.), интрон GH (250 п.н.), структурную последовательность GH (750 п.н.), З'-нетранслируемую зону GH (450 п.н.). Направление транскрипции BPV и GH одинаково в плазмиде BPVMG7 и противоположно — в BPVMG6. ¦, BPV69T; —, 5'-фланкирующие последовательности МТ; ?, 5'-нетранслируемый лидер МТ.
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
51Ь
Рис. 9. Ген ^-интерферона человека в BPV-плазмидах. A. pBPV69T-iFNfil; ЯшсИП-фрагмент ДНК (1,6 т.п.н.), содержащий ген [5-интерферона и ?coRI-ЯшсПН-фрагмент pBR322 (28п.н.), был введен в обеих ориентациях в сайт HinAlll векторной молекулы pBPV69T, содержащей модифицированный SaH-San-фрагмент (3,7 т.п.н.) плазмиды pBR322. В pBPV69T-IFNJH 117—13 транскрипционная ориентация BPV и гена интерферона одинакова; в pBPV69T-IFNJJ1 117—211—противоположная i[52, 53]. Б. pBPV-IF; ген [5-интерферона человека (1,6 т.п.н.) клонирован в виде .Бсс^ЬЯ/даПН-фрагмента в делецион-ном мутанте pBR322, утратившем «токсичную» последовательность; эта конструкция получила обозначение pIFR. HinAlll-ВатШ. 69Т-фрагмент лигировали с pIFR, обработанной рестриктазами Hindlll и BamHI; полученная конструкция была обозначена как pBPV-IF. Направление транскрипции гена интерферона и ДНК BPV совпадает. Перед трансфекцией плазмидные последовательности удаляли рестриктазами: в случае pBPV69T-IFN — Sail, а в случае pBPV-IF —Sail и Pvull. Ц, BPV69T; —, ген [5-интерферона;
----, pBR322.
3.3.2. Эффективность трансформации
Известно, что последовательности плазмидной ДНК. ингибируют трансформацию клеток 69Т-фрагментом BPV (см. разд. 3.1. и табл. 3). Вот почему перед тем, как ввести гибридную ДНК в клетки С127, эти последовательности удаляли с помощью рестриктаз. Для трансфекции использовали как линейные молекулы, так и молекулы, рециклизованные путем лигирования, например, в случае плазмид BPVMG (см. рис. 8 Б) [49]. Линейные молекулы при попадании в клетку подвергались естественной рециклизации (см. раздел 3.3.3.) и зачастую утрачивали рестрикционный сайт, как например BPV69T-rIl [43] (см. рис. 6).
В случае плазмид pBPV-j3 [46] и pGP [48] удаление ингибирующих плазмидных последовательностей не является обязательным условием для эффективной трансформации клеток. Эти
-512
Глава 8
Рис. 10. Гибридные плазмиды BPV-MMTVLTR. Все плазмиды этой серии содержат 69Т-фрагмент BPV и модифицированную плазмидную последовательность pBR322, в которой ?coRI-caftT конвертирован в сайт San. А. рМ16 и рМ17 содержат LTRMMTV (1,3 т.п.н.), соответственно, в прямой и обратной транскрипционной ориентации относительно ДНК BPV. Б. рМ18 и рМ19 содержат ген v-ras H-MSV, состыкованный с З'-концом LTRMMTV. В рМ18 направление транскрипции v-ras и ДНК BPV совпадает; в рМ19 их транскрипция происходит в противоположных направлениях. В. рМ20 и рМ21 включают фрагмент (700 п.н.), содержащий энхансер (72 п.н.) H-MSV, состыкованный с б'-концом MMTV LTR. В рМ20 направление транскрипции v-ras и ДНК BPV совпадает; в рМ21 они транскрибируются в противоположных направлениях. После удаления pBR322 с помощью Sail гибридная ДНК была использована для трансфекции как в линейной форме, так и после рециклизации путем лигирования. Эффективность трансформации рециклизованной ДНК составляет от
3000 до 7000 фокусов на 1 мкмоль ДНК. В> BPV69T;-----------¦, pBR322; ?, ген
H-MSV v-ras; —, 5'- и З'-фланкирующие последовательности.
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
513
плазмиды содержат, соответственно, р-глобиновый ген человека и ген гормона роста (GH) крысы; предполагается, что их высокая трансформирующая способность — результат малопонятного стабилизирующего эффекта вставочной ДНК.
Эффективность трансформации варьирует от 10 фокусов на 1 мкг ДНК в случае pM26V4 [57] до 400 в случае pBPV-JJ [46]. Остается неясным, связаны ли наблюдаемые различия в эффективности трансформации с индивидуальными структурными особенностями плазмид или же они обусловлены различиями в применяемых методиках трансфекции, и разной компетентностью реципиентных клеток.
Предыдущая << 1 .. 234 235 236 237 238 239 < 240 > 241 242 243 244 245 246 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed