Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
расстоянии от 5'- и З'-концов транскрибируемого-гена. Используя
разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК,
удается модифицировать клонированные гены и затем после введения
мутантного гена путем генетической трансформации обратно в растения
анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные
методики способствовали изучению нуклеотидных
308
Глава 6
последовательностей, расположенных перед 5'-концом некоторых генов,
которые, как предполагалось, определенным образом регулируют экспрессию
генов, в особенности уровень транскрипции.
6.1.5. Использование трансгенных растений для изучения
последовательностей, регулирующих транскрипцию
Функции коротких регуляторных последовательностей, о которых
упоминалось выше (блоки ТАТА и СААТ), были определены с помощью
мутагенеза. Например, при изменении расстояния между блоком ТАТА и сайтом
САР, менялось положение точки инициации транскрипции [30]. Эти данные
позволяют предположить, что блок ТАТА некоторым образом определяет сайт
начала транскрипции. Данные других экспериментов указывают на то, что
блок СААТ, вероятно, оказывает определенный эффект на уровень
транскрипции. С помощью де-леционного мутагенеза последовательностей,
расположенных в 5'-направлении от начала транскрипции генов малой
субъединицы (МС) РБФК/О и Cab [9, 25, 36, 39], исследовали и другие
участки. Они переключают гены под действием света/темно-ты с помощью
фитохромов (фоторецепторов растений) и обеспечивают органоспецифическую
регуляцию. В этих экспериментах использовали конструкции, состоящие из
последовательностей, расположенных перед 5'-концом различных генов,
которые были соединены либо со своим же геном, либо с "индикаторными"
генами (см. ниже), такими, как ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (cat)
либо неомицинфосфотрансферазы-П (npt-II), и экспрессировались в
трансгенных растениях петунии или табака. Некоторые из этих
последовательностей, кроме того, сохраняли свою тканеспецифичность,
которая в норме связана с экспрессией этого гена, например, различные
уровни транскрипции в листе, стебле и корне. Для получения трансгенных
растений, которые синтезируют необходимый продукт контролируемым образом
в определенных органах, полное понимание природы регуляторных
последовательностей особенно важно.
6.1.6. Изучение регуляторных последовательностей с помощью индикаторных
генов
Определение содержания или активности продуктов, кодируемых
перенесенным геном, представляет собой наиболее прямой способ изучения
экспрессии чужеродных генов в трансформированных тканях растений. Многие
промоторы и предполагаемые регуляторные последовательности изучали путем
со-
Анализ организации и экспрессии генов растений
309
единения с индикаторным геном. Индикаторный ген обычно представляет собой
последовательность, кодирующую бактериальные ферменты, для которых
имеются простые и чувствительные методы определения и чья активность в
тканях растений в норме отсутствует (табл. 2.1). Чаще других используют
гены, кодирующие октопин- и нопалинсинтазы (из т-днк
A. tumefaciens), CAT, NPT-II и GUS.
Изучаемую промоторную последовательность можно соединить с
индикаторным геном путем транскрипционного либо трансляционного слияния.
Для того чтобы получить транскрипционное слияние, область промотора
индикаторного гена вырезают как можно ближе к ATG (кодон инициации
трансляции), и затем этот ген непосредственно соединяют с изучаемым
промотором. Если блок ТАТА нового промотора оказывается на
соответствующем расстоянии (30-40 п. н.) от сайта ATG, то образуется
химерный транскрипт, способный к нормальной трансляции с образованием
фермента дикого типа (рис. 6.2). Если же необходимо получить
трансляционное слияние, то ATG "промоторной последовательности" вместе с
несколькими кодонами гена, который он обычно регулирует, соединяют с
индикаторным геном, у которого в этом случае отсутствует свой собственный
кодон ATG. Последний подход связан с двумя основными трудностями. Во-
первых, соединение генов должно быть осуществлено таким образом, чтобы в
транскрипте не происходило сдвигов рамки считывания и не возникали стоп-
кодоны трансляции, что может приводить к образованию бессмысленных
полипептидов или коротких фрагментов белка соответственно. Во-вторых,
хотя и возможно обеспечить слияние таким образом, чтобы следующий за ATG
кодон представлял собой первый кодон индикаторного гена, это может
потребовать значительных усилий. Таким образом, в большинстве случаев на
:М-конце гена растения подбирается (или конструируется) подходящий
рестриктный сайт, который обеспечивает трансляционное слияние без
нарушения рамки считывания. В таком случае индикаторный ген должен
функционировать более или менее нормально, причем к N-концу кодируемого
им белка добавляется несколько лишних аминокислот. Если таким образом
использовать CAT и NPT-II, то лишние аминокислоты (см. например, [46]) не
