Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Карбоксипептидаза '.
Этот фермент может быть выделен из экстрактов поджелудочной железы в чистом виде [128], но до использования для определения последовательности аминокислот его рекомендуется инкубировать с диизопропилфторфосфатом, чтобы инактивировать возможные примеси химотрипсина, трипсина и субтилизина [122, 267, 300]. Основные свойства и специфичность действия карбоксипептидазы подробно рассмотрены в ряде работ [228; 293]. В других работах [114, 136, 226, 320] приводятся данные об использовании фермента для определения последовательности аминокислот в белках. Карбоксипептидаза специфична в отношении С-концевых аминокислот
Реагенты, Селективно отщепляющие концевые остатки 231
в пептидах и белках, содержащих свободную а-карбоксиль-ную группу строения
_ і
-nh-ch-co! nh-ch-cooh
С-Концевые амидные остатки, подобные остаткам в окси-тоцине и вазопрессине [85], устойчивы к действию фермента.
Скорость отщепления С-концевых остатков определяется в основном характером боковой цепи R, но боковая цепь R' соседнего остатка также Может оказывать влияние на скорость реакции. Наиболее быстро отщепляются ароматические аминокислоты (именно поэтому так важно, чтобы в ферментном препарате отсутствовал химотрипсин), затем следуют концевые аминокислотные остатки с большими алифатическими боковыми цепями. По мере уменьшения размеров боковой неполярной цепи или повышения полярности боковой цепи скорость расщепления уменьшается.
Так, гликокол и аспарагиновая и глутаминовая кислоты отщепляются медленно, а скорость отщепления аргинина и ли-зяна зависит от степени чистоты фермента. В последнее время в препаратах карбоксипептидазы низкой степени чистоты обнаружена новая основная карбоксипептидаза [104, 105], специфически расщепляющая С-концевые пептидные связи, в образовании которых участвуют аминогруппы лизина и аргинина.
Пролин и оксипролин полностью устойчивы к действию фермента. ^Цистеин в продуктах расщепления не был обнаружен. Полуцистин, если он присутствует в продуктах расщепления, мог образоваться за счет разрыва пептидной связи; при этом связь с полипептидной цепью дисульфидным мостиком сохраняется. Окисление остатков цистина в цистеиновую кислоту не должно давать "способную отщепляться под действием карбоксипептидазы группу, так как она содержит заряженную боковую цепь, но восстановление и алкилирование' до —SCH2CONH2-rpynn приводят к образованию нейтрального остатка. Такой остаток был недавно обнаружен [198] в. гидролизатах, полученных при действии карбоксипептидазы на восстановленный и алкилированыый пролактин, что свидетельствует о присутствии С-концевого полуцистинового остатка.
Влияние предшествующего аминокислотного остатка на скорость отщепления концевой группы лучше всего можно показать на примере соединений, содержащих остаток про-
232
Селективное расщепление белков
лина. Так, в инсулине, цепь Б которого содержит С^-концевон участок состава —Про.Лиз.Ала.ОН, быстро отщепляется ала-нин, тогда как отщеплению лизина препятствует сочетание полярной боковой цепи остатка лизина и предшествующего пролильного остатка [136, 267]. В вирусе табачной мозаики с С-концевым участком —Про.Ала.Тре.ОН [37, 229] отщеп ляется только треонин [138], в то время как в кортикотро пине, С-концевой участок которого имеет состав —Про.Лёй Глу.Фе.ОН, скорость отщепления уменьшается в порядке фе-нилаланин, глутаминовая кислота, лейцин [136, 284, 339], и реакция прекращается, когда остаток пролина становится С-концевым.
Определение числа пептидных цепей в белке путем количественного измерения скорости отщепления аминокислот может оказаться ненадежным, если два соседних аминокислотных остатка отщепляются почти с одинаковой скоростью. Это наблюдается в случае ростового гормона быка, в котором два остатка фенилаланииа быстро отщепляются карбоксипеп-тидазой, после чего происходит отщепление аланина, лейцина и серина. В этом белке имеются два N-концевых остатка, но расщепление гидразином позволило обнаружить только один С-концевой остаток фенилаланина^ Полученные при расщеплении белка карбоксйпептидазой результаты объясняются тем, что С-концевой участок имеет состав —Фе.Фе.ОН [198].
Данные, полученные при отщеплении концевых групп, как правило, легче истолковать, если более или менее точно известно, что белок состоит из одной открытой полипептидной цепи. Если аминокислотные остатки располагаются в порядке уменьшения скорости гидролиза, начиная от С-концевого остатка, то часто можно сделать правильные предположения о последовательности расположения аминокислот. Представление о трудностях, с которыми приходится сталкиваться в ходе подобных исследований, можно составить на примере рибонуклеазы, которая, как известно [249], содержит одну полипептидную цепь с С-концевым участком —Асп. Ала. Сер. Вал. ОН. На основании результатов первоначальных опытов [11] по расщеплению рибонуклеазы карбоксйпептидазой сделан вывод, что С-концевой ' участок имеет строение —Мет.Тир.Ала(Лей или Илей, Фе).Вал.ОН, однако, только при использовании препарата карббксипептидазы, тщательно обработанной диизопропилфторфосфатом, получены данные, свидетельствующие, что С-концевой участок в действительности имеет строение— (Ала,Сер).Вал,ОН[249].
