Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
CH2OH HaSO4 ^ —COOCH2 CHXOOCOCH, >
— CONHCHCO- "^°5^ NH^CHCO-
он- —COO CH2OH CHjOH-HCi
-I--5--> ,
CH3CONHCHCo— CH2OH . V —.
> 1
NH^CHCO—
В фиброине шелка количество остатков треонина очень невелико по сравнению с остатками серина, поэтому в продуктах расщепления не было обнаружено свободных концевых групп треонина. Однако впоследствии были исследованы белки, содержащие большее количество остатков треонина, причем часть остатков серина оказалась устойчивой^ а остатки треонина — гораздо менее реакционноспособны, чем остатки серина [247, 343]. В лизоциме, например, приблизительно 80% остатков серина претерпевают миграцию ацильной группы, в то время как подобная перегруппировка затрагивает всего 30% остатков треонина [97].
Обработка безводной серной кислотой глютена [343] и глиадина [247] сопровождалась миграцией ацильной группы у остатков серина (соответственно на 100 и 70%); у остатков
—COOCH2 I
CH3CONHCHCo-
220 - j Селективное расщепление белков
треонина подобной миграции не наблюдалось (при окислении периодатом образовался ацетальдегид). В глютене и глиадине на каждые три остатка серина приходится примерно один остаток треонина, так что различие в реакционной способности этих аминокислотных остатков весьма существенно.
По предложенному Эллиотом [96] методу эти белки после обработки серной кислотой были подвергнуты ацилированию, омылению и частичному дезацилированию хлористым* водородом в метаноле. Попытки фракционировать продукты ионо-форезом и хроматографированием не имели успеха (были получены только отдельные пики). Возможно, эти неудачи частично объясняются введением .в молекулы сульфогрупп. Для блокирования свободных аминогрупп глиадина был предложен другой метод [247], заключающийся в дезаминировании действием азотистой кислотой. При этом N-концевые остатки серии а превращаются в остатки глицериновой кислоты, и в гидролизатах обработанного подобным образом белка было обнаружено меньшее количество серина. К сожалению, работ, посвященных омылению дезаминированных белков и последующему фракционированию продуктов гидролиза, не опубликовано, так что до сих пор не ясно, можно ли осуществить выделение ожидаемых пептидных фрагментов. Денуэль [71] отметил трудность деметилирования и дезаминирования аминогрупп (ср. [167]) других белков, оказавшихся свободными в результате воздействия на белки серной кислоты.
Рамачандран и Макконнел [247] изучали изменение содержания аминного азота белков в зависимости от времени воздействия на белок серной кислоты. При —35 и 0° содержание аминного азота достигало максимума и затем падало, что, возможно, объясняется реакцией аминогрупп с образованием сульфаматов. Это уменьшение содержания аминного азота не позволяет установить оптимальную продолжительность обработки белка серной кислотой. Рейц и сотр. [253] не обнаружили признаков взаимодействия аминогрупп с серной кислотой, но продолжительность реакции в их опытах составляла всего около 30 мин, тогда как другие авторы проводили реакции в течение 2 суток и более.
Обычно все же содержание аминного азота служит наиболее точным показателем степени ацильной перегруппировки. Аминогруппы в белке, в котором произошла подобная перегруппировка, становятся сравнительно малодоступными для различных реагентов. Так, попытки [57, 96] ввести ди-нитрофторбензол (ДНФБ) в реакцию^ со свободными аминогруппами привели к получению ожидаемого ДНФ-серина (и
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 221
ДНФ-треонина из лизоцима [97]), но выходы оказались значительно ниже, чем этого можно было ожидать на основании данных о содержании аминного азота. Реакция в щелочной среде осложняется обратной перегруппировкой, которая, как указывалось выше, протекает чрезвычайно быстро. При рН5 реакция с ДНФБ протекает медленнее, но миграции ацильной группы от О к N не наблюдается. При pH 8,5 и 20° в течение 2,5 час в фиброине шелка в реакцию с ДНФБ вступило только 4,5% азота серина, а при pH 5 и той же температуре за 4 час прореагировало 23%. Всего в реакцию может вступить 62% азота серина, что установлено на основании, данных о снижении содержания аминного азота при стоянии белка в щелочной среде (pH 9) в течение нескольких часов [96].
В другой работе [167], посвященной исследованию лизоцима, в котором ацильная группа мигрирует от N к О, сообщается, что после взаимодействия белка с ДНФБ при pH 5 в течение 8 час не было обнаружено ни ДНФ-серина, ни ДНФ-треонина. Однако при разрыве О-пептидильной связи можно получить ожидаемые результаты, используя периодат-ный метод определения концевых оксиаминокислотных остатков [97] или динитрофенилирование [247].
Несколько неожиданным является то, что ацетилирование или формилирование при pH 5 дает гораздо лучшие результаты, чем динитрофенилирование. Этот вывод основан на косвенных данных, так как ацетилсерин не может быть выделен, так как он, подобно ДНФ-серину, легко гидролизуется. Кроме того, белок, содержащий ДНФ-сериновый остаток, вследствие неустойчивости ДНФ-групп [96] не удалось расщепить разбавленной щелочью подобно тому, как расщепляется белок, содержащий ацетилсериновую группу. Расхождение данных могло быть вызвано увеличением степени разложения ДНФ-серина при гидролизе, как это наблюдалось в случае других белков [42, 119].
