Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
224
Селективное расщепление белков
хотя активность фермента восстановилась полностью. Количество пептидных связей, у которых произошла ацильная перегруппировка от N к О, не установлено, но по крайней мере одиннадцать остатков из девяти остатков серина и семи остатков треонина были затронуты перегруппировкой [312].
Бромная вода
В ходе исследований строения окситоцина [84, 221, 255] была сделана попытка окислить этот полипептид бромной водой. В отличие от окисления окситоцина надуксусной кислотой, когда образуется один продукт реакции, при окислении бромной водой были получены два пептидных обломка. При действии бромной водой на полипептид, предварительно окисленный надмуравьиной кислотой, образуются те же самые обломки. Расщепление окситоцина представлено на рис. 12.
При действии бромной воды на окситоцин происходят окисление обеих половин цистиновых остатков в ?-сульфо-аланильные остатки, бромирование тирозина и расщепление тирозилизолейцильной связи. Направление реакции с бромной водой не зависит от присутствия в цепи окситоцина остатка изолейцина, так как в вазопрессине, который вместо изолейцина имеет фенилаланин, окисление бромной водой приводит к тем же результатам [242]. При расщеплении вазопрессина происходит заметное разложение и удается выделить только один крупный пептидный фрагмент.
Бромная вода содержит около 3,5% брома и имеет величину pH, равную примерно 2. В работах, посвященных изучению необычного расщепляющего действия бромной воды [254], сообщается, что бромирование тирозина в предварительно окисленном надмуравьиной^кислотой окситоцине в ледяной уксусной кислоте или в водном растворе может не сопровождаться разрывом связи, если концентрация раствора составляет 0,5 н. по HBr. Дальнейшая обработка этого бронированного и окисленного окситоцина 0,05%-ной уксусной кислотой при комнатной температуре в течение 24 час, 1 н. раствором HBr или слабым водным раствором NH3 при температуре от —5 до —10° в течение 45 мин не привела к .расщеплению молекулы. Однако в результате обработки продукта бромной водой при температуре от —5 до —10° получаются два пептидных обломка. Расщепление обусловлено чувствительностью ароматического кольца тирозина к галогени-рованию. Это подтверждается тем, что ДНФ-производное окисленного окситоцина, содержащее вместо фенольной группы динитрофенильную группу, при обработке бромной водой
NH2NH2 . - : NH2NH5
I I Бромная вода II
Н.Ци.Тир.Илей.Глу.Асп.Ци.Про.Лей.1^h-NH2--;-*- H1UHSO3H1Br4Tnр.ОН + Н.Илей.Глу.Асп.Ци503Н.Про.Лей.Гли.Мг1г
Надмуравьиная кислота ' - _ • ;• . ' Бромная вода
Бромная вода
NH2NH2 . NH2NH2
І І * Вром в уксусной Il _
H.U«S03H.THp. Илей. Глу.Асп.ЦиБ O3H. Про.ЛетГл'и.Ш,-кїїЕНЗте-*¦ Н.Ци503Н.Вг2Тир.Илей.Глу.Асп.Ци303Н.Про.Лей.Гли^Нг;
или 0,5н. HBr ^ (Устойчив в разбавленной кислоте и разбав-
Фтордннитробензол ¦•• ,.' , • ленном водном растворе аммиака)
О-ДНФ
I
NH2 NH2 I 2 I 2
ДНФ—UhSOjH. Тир. Илей. Глу.Асп.ЦивОзН.Про. Лей. Гли. NH2 (Устойчив к бромной воде)
Рис. 12. Селективное расщепление производных о,кситоцина бромной водой. ВгУГир — остаток 3;б-дибромтирозина. "
226
Селективное расщепление белков
не претерпевает ни расщепления, ни замещения в бензольном кольце.
Подобное образование фрагментов является одним из немногих известных примеров селективного расщепления химическими методами, однако для теоретического обоснования этой реакции пока еще недостаточно фактических данных. Возможно, что лабильность связи, в которой участвует карбоксильная группа тирозина, обусловлена близостью бромиро-ванного остатка тирозина и остатка ?-сульфоаланина.
Представляет интерес исследовать действие бромной воды на окисленную рибонуклеазу, в которой присутствуют обе рассмотренные в случае окситоцина группировки: —ЦиБОзН.Тир.Лиз— и —Тир.Ци503Н.Асп (NH2)—.
96 97ч 98 J25 - 26 27
В окисленном инсулине в цепи А имеется группировка —Асп (NH2) .Тир.ЦиБОзН.Асп (NH2) .ОН, и как окислен-
18 Г9 20"" 21А '
ный инсулин, так и выделенная из него цепь А при обработке бромной водой при температурах от —5 до —10° дают пептид ТЦиБОзН . Асп (NH2), что указывает на разрыв связи за остатком тирозина [319]. Количественная сторона этого расщепления еще требует изучения.
Селективное расщепление, затрагивающее остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот
Селективное выделение из белков аспарагиновой кислоты.
Пептидные связи по обеим сторонам остатка аспарагиновой кислоты в молекуле белка особенно легко гидролизуются разбавленными кислотами [233], причем степень гидролиза зависит от pH раствора, а не от концентрации используемой кислоты [32, 189]. Так, из альбумина сыворотки крови быка за 18 час при 100° и pH 2,14 выделяется 44% остатков аспарагиновой кислоты в виде аминокислоты, в то время как при pH 3,15 освобождается всего 26% остатков кислоты [189]. При экстракции эластина 0,25 M щавелевой кислотой при 100° "был получен растворимый белок; единственной выделенной свободной аминокислотой оказалась аспарагиновая кислота [235]. Однако присутствие в продукте реакции пептидов с короткой цепью и результаты определения концевых групп [24, 234] указывают на значительную степень гидролиза и других пептидных связей. Исследования, проведенные на модельных соединениях [73], позволили сделать вывод о лабильности связей остатков серина и треонина. Применение описанного выше метода гидролиза для исследования цепи А окисленного
