Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Молекулярный вес папаина равен примерно 20500; его молекула содержит Приблизительно 180 остатков аминокислот, но при инкубированиислейцинаминопептидазойот N-koh-цевого участка цепи папаина отщепляется до двух третей остатков аминокислот без потери исходной ферментной активности [148].
Максимальная активность папаина проявляется при pH 5—7,5; при более высоких значениях pH возможны химические превращения и реакции переноса [117, 178].
Установлено [27], что частично очищенный папаин способен атаковать синтетические субстраты амидного и пептидного типа. Аналогичными свойствами обладает и кристаллический фермент [178], который вызывает расщепление, хотя и с весьма различными скоростями, всех синтетических субстратов для трипсина, пепсина, химотрипсина, карбоксипепти-дазы и пептидаз. Из известных в настоящее время субстратов папаина наиболее чувствительным оказался бензоил-/-арги-ниламид. Атака фермента иа фракцию А окисленного инсулина свидетельствует о широком спектре гидролитического действия» напоминающем действие пепсина, хотя степень разрыва различных связей этими ферментами весьма различна.
Связи, атакуемые папаином, показаны на рис. 1. Представляет интерес тот факт, что в незатронутой фракции А
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 211
расщепляется связь —ЦиБОзН.Сер — , а в пептидном осколке,
11 12
состоящем из остатков 1—13 этой цепи, вместо этой связи разрывается связь —Сер.Вал—. Это также показывает, что
9 10
разрыв чувствительной к гидролизу связи определяется не только характером остатков, участвующих в образовании связи, но и другими факторами.
Протеаза плесени и субтилизин. Протеаза плесени, выделенная в кристаллическом виде из фильтратов культуры А. огу-гае, оказалась во много раз активнее папаина при гидролизе казеина и гемоглобина [66]. Найдено, что этот фермент приводит к более глубокому гидролизу цепей окисленного инсулина, чем все рассмотренные выше ферменты [269]. Связи, разрываемые протеазой плесени, показаны на рис. 1 и 2.
Субтилизин был получен в кристаллическом виде Гунтле-бергом и Оттезеном [130] из среды, в которой выращивался штамм В. subtilis. Первоначально этот протеолитический фермент был обнаружен по его способности вызывать ограниченный гидролиз нативного овальбумина, сопровождающийся образованием другого способного кристаллизоваться белка — плакальбумина [200] — и гексапептида Ала.Гли.Вал.Асп.Ала. Ала [231].
Специфичность разрыва этой связи весьма примечательна, если учесть разнообразие пептидных связей, разрываемых этим ферментом в других белковых соединениях. Вообще субтилизин характеризуется таким же широким диапазоном специфичности, как и плесневая протеаза. Оба фермента при кристаллизации выпадают в виде кристаллов одинаковой формы, но они имеют разные изоэлектрические точки [130], поэтому их вряд ли можно считать идентичными.
Окисленный окситоцин (XIII) расщепляется субтилизином по указанным ниже связям [326]:
Н.Ци803Н.Тир!!Илей.Глу(КН2).Аеп (NH2) —
¦ 1 1
Ци803Н.Про.Лей.Глу.НН2
T
XIII
В цепи Б окисленного инсулина (см. рис. 2) из 29 связей субтилизин гидролизует 18 связей [324], а в природном инсулине свиньи [213] в цепи Б гидролизуется только 13 связей, что свидетельствует о влиянии структурных факторов на ход
14*
NH5S-S NH5 NH, NH2
H. Гли. Илей. Вал.Глу. Глу. Ци.Ци.Тре.Сер. Илей. Ци. Сер. Лей. Тир. Глу. Лей. Глу. Асп.Тир.Ци. Асп. ОН
• t |t " t f .. M ti
I
NH8NH, S j
НіФе.Вм^\сп.Глу.Гис.Лей.'Ци.Г^Сер.Гис.Лей^
MtIItMf tit t
Рис. 11. Порядок расположения аминокислот в инсулине свиньи и связи в нем, гидролизуемые
субтилизином.
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 213
протеолиза. Связи, разрываемые субтилизином в инсулине свиньи, показаны На рис. 11, а соответствующие связи глю-кагона — на рис. 3. В обзоре Анфинзена и Редфилда [10] приводятся имеющиеся данные по действию субтилизина на рибонуклеазу.
Вряд ли имеет смысл делать какие-либо обобщения, касающиеся специфичности этого фермента. В случае инсулина наблюдается избирательное действие на связи, образованные карбоксильной группой лейцина, тогда как в отношении глю-кагона это не ясно [287]. Поэтому создается впечатление, что в образовании гидролизуемых субтилизином связей могут принимать участие все аминокислотные остатки, за исключением, по-видимому, пролина.
Легочная протеиназа I и реннин. Очищенная протеиназа, выделенная из легкого быка, разрывает в цепи Б окисленного инсулина те же связи, что и пепсин [67]. Синтетические субстраты для легочной протеиназы до сих пор не найдены.
Изучено также действие кристаллического реннина на окисленный инсулин [103]. Найдено, что он гидролизует некоторые связи, атакуемые пепсином. В условиях, в которых исключена возможность загрязнения препарата реннина пепсином, было установлено, какие связи разрывает этот фермент (см. рис. 2).
Тромбин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина является примером ограниченного протеолиза, затрагивающего только две или три связи примерно из 3000 связей фибрина и приводящего к образованию двух полипептидов, которые были охарактеризованы [18, 30]. Оба полипептида содержат аргинин. Поскольку тромбин гидролизует синтетические субстраты, например метиловый эфир то-луолсульфонил-/-аргинина [285], был сделан вывод, что в фибриногене происходит расщепление аргинильных связей. Однако лизин в одном из-пептидов может участвовать в образовании разрываемой связи, так как субстратами тромбина являются как этиловый эфир лизина, так и лизилаланиновая связь в цепи Б окисленного инсулина [95]. Протеолитического действия тромбина на овальбумин и миозин кролика не было обнаружено [18].
