Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
НО NH2-CH1 XV
—> C6H5COOCH2CH2NH+Cr XVI
2
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 217
Филипс и Бальци [239] установили, что при этой реакции промежуточно образуется неустойчивое оксиоксазолиди-новое соединение XVI. При этом в результате побочной реакции отщепляется вода и образуется оксазолиновое производное XVII, которое иногда удаетСя выделить. Водные растворы кислот превращают соединение XVII в сложный эфир XVI.
C6H5—с
О—CH2
^N-CHj
XVII
Филипс и Бальци осуществили миграцию ацильной группы от N к О в следующих условиях. Этаноламид бензойной кислоты обрабатывался 3,3 н. раствором хлористого водорода в абсолютном спирте в течение 1 недели при комнатной температуре. Выход солянокислой соли аминоэтилбензоата составил 65%. В отличие от неполной и медленной миграции ацила от N к О обратная реакция протекает мгновенно и практически количественно. Так, через 2 мин после титрования соединения XVI до pH 10 и обратного титрования до рН5 95% сложного эфира перегруппировывается в амид. Попытка провести ацильную перегруппировку в разбавленной соляной кислоте (0,04 н.) оказалась неудачной.
В белках те же реакции могут происходить с гидроксиль-ньши группами остатков серина и треонина, при этом обычная пептидная связь (XVIII) превращается в О-пептидиль-ную связь (XIX).
R—CHOH
I H+
CHR'—СО—NH-CH-CONH- ?-» —CHR'—СО—О—CH-R
• он" + I
NH3-CH-CONH-XVIII XIX
Миграция ацильной группы от N к О при гидролизе пептидов концентрированными кислотами подтверждается результатами анализа [74, 124], согласно которым содержание оксиаминокислотного азота (определялось перибдатным методом или переводом в динитрофенильное производное) увеличивалось быстрее, чем аминокислотного азота (определялось по Ван-Слайку). При низких температурах перегруппировка происходила более полно. Исследования относительных
218
Селективное расщепление белков
скоростей гидролиза N-бензоилаланина, N-бензоилсерина и 0-бензоилсерина при 30° в Юн. соляной кислоте [78] показали, что за 4 суток гидролиз указанных соединений прошел на 6, 27 и 58% соответственно. Более высокая стойкость к гидролизу N-бензоилсерина по сравнению с О-бензоилсери^ ном указывает на то, что в данных условиях быстрой миграции ацильной группы от N к О не происходит, так как в противном случае степень гидролиза N. и О-ацильных производных была бы одинаковой. Дальнейшие опыты [72] показали, что селективность гидролиза эдестина, овальбумина и гемоглобина в спиртовом растворе хлористого водорода, Юн. серной кислоте или после предварительной обработки хлористым тионилом была не выше, чем при гидролизе 12 н. соляной кислотой. Однако после предварительной обработки безводной серной кислотой и гидролиза белка 6н. соляной кислотой при 18° в течение 6 час с целью расщепления О-пептидиль-ных связей специфичность расщепления .повышается. Наиболее показательные результаты получены с эдестином, в котором 72% сериновых и 33% треониновых связей гидроли-зовались соответственно в 70 и 32 раза быстрее, чем другие пептидные связи.
При действии концентрированной серной кислоты на белки, содержащие спиртовые группы, образуются- соответствующие моноэфиры серной кислоты. При повышении температуры реакционной смеси от —35 до 20° происходит'Частичное сульфирование циклических групп [253]. Инсулин при обработке серной кислотой не теряет биологической активности [123]. При длительном воздействии увеличивалось содержание а минного азота и образовывалось большее количество диализуе-мого вещества при разбавлении реакционной смеси водой со льдом. Этих результатов и следовало ожидать, если в указанных условиях происходили миграция ацильной группы от N к О и последующий гидролиз возникших в пептидах эфирных связей водным раствором кислоты.
При взаимодействии между серной кислотой и реакционно-способными участками белков образуется вода, поэтому, для того чтобы среда оставалась безводной, необходимо принимать особые меры предосторожности. Однако при сравнении' результатов, полученных с концентрированной и дымящей серной кислотой, заметного различия в степени перегруппи-ровки.не было обнаружено [72].
В результате обработки концентрированной серной кислотой в течение 3 суток при 21° в фиброине шелка максимально 62% пептидных связей превращается в O-пепїидильньїЄ' связи [96, 97]. Хотя вследствие изменений в скручивании пеп-.
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи
219
тидных цепей обратная реакция белков может оказаться более медленной, как это ранее отмечалось в отношении аминог этилбензоата, было установлено, что выдерживание белкового соединения при рН9 в течение нескольких часов значительно снижает содержание аминного азота.
Для повышения специфичности расщепления сложноэфир-ной связи по сравнению со специфичностью кислотного гидролиза Эллиот ацилировал свободные аминогруппы при рН5. В результате обработки ацилироваиного белка 0,01 н. щелочью при комнатной температуре в течение 1,5 час значительно увеличивается количество диализуемого азрта, что согласуется с гидролизом эфирной связи с образованием смеси ацетил- или формилсерилпепвддов. От этих пептидов ациль-ные группы были отщеплены обработкой на холоду раствором хлористого водорода в метаноле; окисление периодатом продукта реакции позволило установить, что из общего числа остатков серина в цепи 62% составляют концевые свободные остатки. Описанные выше реакции, которые Эллиот [96] использовал для селективного расщепления пептидных цепей по остаткам серина и треонина, протекают по следующей схеме:
