Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
NH—CHCONHCH2CONHc6H1,+ c6h6COOH i i
со ch2 ...
\ /
ch2
C4H6COMHC H с ONCHjCONHC6H13 CH2CH2CO
54?
46?
Производное дикетопиперидина
c6h5con hc hcooh
-» C6H5CONHCHCONHCH2CONHC6Hb
CH2CHjCOOH о-Глутамилпептнд
CHjCHjCONHCHjCON HC6Hn j-Глутамилпептид
Хотя в результате реакций в указанных сравнительно мягких условиях удаётся добиться частичного расщепления пептидной цепи, совершенно ясно, что течение реакции в зна-чительной степени определяется порядком расположения аминокислот в "исследуемом соединении. Перегруппировка в т-глутамильные изомеры и сравнительно низкие выходы позволяют сделать вывод, что в настоящее время этот метод непригоден для селективного расщепления длинных пептидных цепей.
РЕАГЕНТЫ, СЕЛЕКТИВНО ОТЩЕПЛЯЮЩИЕ КОНЦЕВЫЕ ОСТАТКИ
• Ферменты
Известны ферментативные методы определения N-и С-кон-цевых остатков. Преимуществом этих методов является возможность осуществления реакции в мягких условиях и использования небольших количеств белков, так как отщепленные аминокислоты можно определять в микроколичествах
Таблица S .
Реакции последовательного расщепления пептидов путем конденсации реагента с «-аминогруппой
Реагент
Продукт конленсацин
Циклическое производное
Литература
Фенилизонианат C8H5NCO
C6H5NHCONHCHRCo—
CHR-CO
I I
NH N-C6H6
\С/ л
1
Фенилизотиоцианат C6H5NCS
C6H5NHCSjHCHRCO—
Ii
О
б-Замещенный 3-фенилгидантоин
CHR-CO I f
NH N-C6H5
Il s
5-Замещенный 3-фенилтиогидан-TO ин
CHR-CO I I NH S
W
к
87
Сероуглерод CSg
-SCSNHCHRCO—
191
Метилметоксидитио-карбамат (диметил-ксантогенат) CH3OCSSCH3
CH3OCSNHCHRCO-
Il S
4-Замещенный 2-тиотиазолидон-5
CHR-СО
I I NH S
W Il
176
Метил-м-ацетилдитио-карбамат
CH3CONHCsSCH8
CHjCONHCSNHCHRCO-
S
4-Замещенный тиазолиддион-2,5
CHR-CO I I NH NH
W
Il
S
5-Замещенный 2-тиогидаитоии
99
Реагенты, селективно отщепляющие концевые остатки 22С
применение при изучении природных веществ. Пользуясь ме тодом Эдмана, удалось получить данные о последовательности аминокислотных остатков на N-концевых участках белков, а также пептидных обломков. В связи с этим в дальнейшем будут рассмо-грены только примеры использования фенилизотиоцианатного метода. Реакции,. протекающие при последовательном расщеплении пептидов фенилизоцианатом по Эдману [89]:
C6H5N=C=S +CHRCONHCHR'CO— ?~9 > •
CHR-CONHCHR'CO I
NH NH^-C6H5
\ /¦ С
NH2
Быстрое расщепление
H+ в войной или безводной среде
CHR-CO + NH3CHR'CO—
-»Il
N S - •
с
Фенилтиокарбамилпёптид
NH-C6H5 2-Анилино-4-замещенный 5-тиазолинон
CHR-COOH
Водный раствор кислоты]
NH NH-C6H5
V
Il S
Фенилтиок^рбамильное производное аминокислоты
Водный саствор кислоты < Медленное расщепление'
Нагревание
CHR - I . I NH N
V
СО
-С„Н5
5-Замегценный 3-фенилтиогидаитоин
Вместо фенилиЗотиоцианата было предложено применять замещенные изотиоцианаты, например 3,5-динитро-4-диме-Тиламинофенилизотиоцианат [252] и п-азофенилфенилизотио-цианат [248], которые имеют то преимущество, что образуют окрашенные производные. В качестве реагента был предложен также и-иодфенилизотиоцианат [50], так как в этом случае можно использовать меченые атомы. Указанные реагенты до сих пор не нашли широкого применения. Кроме того, из данных, приведенных различными авторами, не ясно, цикли-зуются ли производные этих реагентов быстрее, чем производные незамещенного фенилйзотиоцианата.
Реакция фенилйзотиоцианата с амино- или а-иминогруп-пой гладко протекает при pH 8—9 и 40° обычно в смеси пиридин— вода или диоксан — вода. Требуемая величина pH
230
Селективное расщепление белков
хроматографированием реакционной смеси на бумаге [114, 320]. В ряде случаев удается определить последовательность расположения аминокислот, так как отщепление N-или С-концевого остатка «обнажает» новую концевую группу, которая также может быть отщеплена действием фермента. Скорость отщепления последующих концевых групп может меняться в очень широких пределах: от скорости отщепления первой концевой группы до значительно более низкой скорости.
Поскольку при ферментативном отщеплении концевых групп не происходит ни рацемизации, ни денатурации, продукты расщепления биологически активных субстратов пригодны для выяснения вопроса о влиянии отщепления этих групп на биологическую активность [10].
К недостаткам ферментативных методов относится то, что область их применения ограничивается только аминокислотными остатками с /-конфигурацией и свободными а-амино-или а-карбоксильными группами. Кроме того, пептидные связи, образованные некоторыми аминокислотными остатками, не разрываются под действием ферментов, а влияние предшествующих остатков может оказаться достаточным для того, чтобы воспрепятствовать гидролитическому отщеплению остатков, которые, судя по данным о специфичности действия фермента, могли бы отщепляться. Наиболее важным условием успешного применения рассматриваемых ниже ферментов является отсутствие примесей эндопептидаз. Небольшие количества этих примесей приводят к разрыву внутренних пептидных связей, в результате чего появляются новые суб-CTPa1TbI для фермента. Субстрат также должен быть настолько чистым, чтобы примеси не могли помешать/истолкованию полученных результатов.
