Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Время от времени предлагались различные методы определения концевых групп пептидов, основанные на использовании тонких химических реакций. Как правило, эти методы [106, 320] дают лишь низкие выходы или недостаточно разработаны, чтобы их с успехом можно было использовать для исследования природных полипептидов и белков, харакі теризующихся многообразием реакционноспособных боковых цепей.
Метод определения N-концевых групп
Фенилизотиоцианатный и аналогичные методы. Для селективного отщепления N-концевого остатка пептидной цепи предложен ряд методов, основанных на образовании N-заме-щенного соединения типа XX.
CHR'—СО—NH—CHR"CONH— I
nh r
V
Il s
XX
Обработка этих производных кислотой приводит к разрыву первой пептидной связи и образованию циклических тио-гидантоиновых или родственных соединений. Эти циклические соединения можно экстрагировать органическими растворителями и идентифицировать химическими методами или из них можно вновь получить аминокислоту.
Реагенты, используемые для этой реакции, указаны в Табл. 5. Все эти реагенты в мягких условиях (pH 8,5, низкая температура) образуют производные, отличающиеся друг от по скорости циклизации и растворимости в кислотных реагентах, вызывающих циклизацию. Указанные реагенты успёшяо'дарйменялись для исследования простых пептидов, но только фенилизотиоцианатный метод Эдмана нашел широкое
240
Селективное расщепление белков
поддерживается добавлением небольших количеств едкого натра или триметиламина. Измеряя расход щелочи в зависимости от времени, легко определить конец реакции; по расходу щелочи можно также судить о количестве вступивших в реакцию групп [231].
, Циклизация производных фенилтиокарбамила (ФТК) проводилась в различных условиях кислотности. При переходе от аминокислот к пептидам с длинными цепями возникают трудности.
Производные аминокислот обычно циклизуются труднее, особенно в случае глицина, чем те же аминокислоты, входящие в состав пептидов. Для синтеза производных фенил-тиогидантоина (ФТГ) [86, 91] или количественного определения N-концевых остатков ФТК-производные часто циклизуют в 1 н. растворе HCl в течение 1 час при 100°. Однако в этих условиях ФТГ-производные серина, треонина и цистина нестабильны, поэтому их не удается выделить и количественно определить. Кроме того, все ФТГ-производные в кислой среде разлагаются, причем степень разложения возрастает с увеличением кислотности и повышением температуры [114, 317]. В водной среде максимальный выход ФТГ-производных достигается при действии сильной кислоты при-сравнительно низких температурах и по возможности меньшей продолжительности реакции. При низкой температуре реакционной смеси и применении концентрированных кислот (1—5 н.) удалось синтезировать ФТГ-производные серина, треонина и цистина в водной среде [159, 195]. Кроме того, эти соединения легко получаются в среде уксусная кислота — HQ [289].
Для ступенчатого расщепления пептидов разработан метод [113, 114], по которому ФТК-пептид растворяют в 3 н. HCl при комнатной температуре и определяют конец циклизации по изменению поглощения в диапазоне длин волн 235— 275 ммк. По мере образования ФТГ-производного N-концевой аминокислоты максимум поглощения смещается приблизительно от 240 до 262,5 ммк при минимуме около 240 ммк (рис. 13). Если реакция протекает медленно, то ее проводят при более высокой температуре (например, при 40°). Обычно продолжительность реакции при комнатной температуре составляет 1,5—24 час. После завершения циклизации ФТГ-производное экстрагируют этилацетатом, а водный раствор выпаривают досуха при низкой температуре, чтобы избежать нежелательного действия кислоты и возможного гидролиза пептидных связей.
Выход ФТГ-производного вычисляют по максимальной оптической плотности кислого раствора (если отсутствуют
Реагенты, селективно отщепляющие концевые остатки 241.
ароматические аминокислоты), а также по максимальной оптической плотности экстрагированного ФТГ-производного в спирте (максимум поглощения обычно при 267,5 ммк), пользуясь коэффициентами экстинкции идентифицированных
Рис. 13. Кривая поглощения в ультрафиолетовой области ФТК-лейцилглицилаланина и ФТГ-производного лейцина, полученного из него в 3 н. HCl при комнатной температуре через 4 час [114].
О ФТК-лейцилглицилаланнн (0,13 ммоль/л)', ф ФТГ-производное лейцина.
ФТТ-производных [114, 195, 289]. ФТГ-Производные аргинина и гистидина не экстрагируются из кислого раствора, но производное гистидина можно экстрагировать из нейтрального раствора. Присутствие ФТГ-производного аргинина обнаруживают по его максимуму поглощения (268 ммк) в нейтральном водном растворе и хроматографированием на бумаге.
Этот метод нашел лишь ограниченное применение для расщепления некоторых растворимых пептидов с длинной цепью, например окситоцина, цепи А окисленного инсулина [113] и
16 Зак, 1418
542
Селективное расщепление белков
гипертенсина [98]. Экспериментальные трудности встретились в случае окситоцина после пяти последовательных отщеплений N-концевого остатка на втором полуцистиновом остатке, а при исследовании цепи. А инсулина — после пяти стадий отщепления на ?-сульфоаланильном остатке, соответствующем цистеиновой кислоте. В гипертенсине, который не содержит цистина, отщепляются только первые четыре аминокислотных остатка, после чего выходы снижаются. Наблюдениям за ходом циклизации путем периодического измерения поглощения мешало поглощение ароматических аминокислот и их производных.
