Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Рафаэль Р. -> "Успехи огранической химии, Том 1" -> 84

Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.

Рафаэль Р., Тейлор Э., Уайнберг Г. Успехи огранической химии, Том 1. Под редакцией Кнунянца И.Л. — М.: Издательство иностранной литературы, 1963. — 397 c.
Скачать (прямая ссылка): uoc1.djv
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 136 >> Следующая


ФТГ-Производные можно идентифицировать хроматогра-фированием на бумаге [92, 186, 288] и на распределительной колонке [290]. Последний метод пригоден для количественных определений, но можно выполнять также быстрые полуколичественные определения путем элюирования пятен хромато-грамм на бумаге. Пятна проявляются иод-азидным реактивом, специфичным на двухвалентную серу, а при количественных определениях обнаруживаются по сильному поглощению в УФ-области ФТГ-производных [92].

Аминокислоты из ФТГ-производных обычно регенерируют действием гидроокиси бария [86] при 140° в течение 48 час (по другим данным [284], в течение 2 час) или 6 н. HCl при 150° в течение 16 час [194]. Другие авторы [98, 275] предпочитают проводить регенерацию действием йодистого водорода при 140°. ФТГ-Производные желательно идентифицировать непосредственно, так как триптофан, аргинин, серии, треонин, цистеин и цистин разрушаются или лишь частично регенерируются из них кислотами и щелочами, причем при такой обработке образуются другие вещества, дающие положительную реакцию с нингидрином. Другие^ аминокислоты можно регенерировать количественно кислотами ([194], но см. также [108]) или щелочами [284].

По предложенной Эдманом методике [87] пользоваться водными растворами кислот не рекомендуется во избежание случайного разрыва пептидных связей. При действии таких безводных реагентов, как растворы хлористого водорода в нитрометане, диоксане и ледяной уксусной кислоте [88], при комнатной температуре ФТК-пептиды расщепляются практически мгновенно. В случае высших ФТК-пептидов и ФТК-бел-ков эти реагенты дают низкие выходы ФТГ-производных [114, 284, 320], что, возможно, обусловлено нерастворимостью ФТК-производных или слишком жесткими условиями реакции.

Резкое различие между скоростями расщепления ФТК-пептидрв в водных растворах кислот и в безводных кислотах

Реагенты, селективно оТщеНлШЩие концевые остатки 243

навело Эдмана на мысль о необходимости исследования ме-ханизма реакции расщепления [89].

Скорость расщепления в безводных средах определялась по содержанию аминного азота, а не по выходу ФТГ-производного. Хроматографирование на бумаге показало, что соединение, быстро образующееся из ФТК-лейцилглицина,-представляет собой не лейцин-ФТГ, а 2-анилино-4-изобутил-тиазолинон-5 с максимумом поглощения при 252 ммк (см. схему на стр. 239). Нагревание (например, при перекристаллизации) оказывается достаточным, чтобы это соединение превратилось в лейцин-ФТГ. С другой стороны, в безводной кислой среде ФТК-лейцилглицин непосредственно превращается в лейцин-ФТГ, в то время как в водной среде это превращение проходит через стадию образования ФТК-лей-цина и с гораздо меньшей скоростью. Таким образом, различие в скоростях расщепления в водных и безводных средах невелико, но скорости циклизации в ФТГ-производные в этих двух системах заметно отличаются.

Для ступенчатого расщепления ФТК-производных высших пептидов и белков, по-видимому, лучше применять безводные кислотные реагенты, так как при этом снижается вероятность разрыва связей внутри пептидной цепи при многократном последовательном отщеплении концевых остатков. Ступенчатое расщепление ФТК-инсулина в водной среде в присутствии хлоргидрата гуанидина, который удерживает белок в растворе, действием 1 н. HCl при 36° [112] или 0,1 н. HCl при 75° [60] на начальных стадиях происходит нормально. Однако при использовании разбавленных кислот помимо ожидаемых ФТГ-пронзводных на последующих стадиях отщепления образуются все возрастающие количества других фенилтиогидан-тоинов, что свидетельствует о расщеплении других пептидных связей.

Наиболее удачной из всех описанных методик расщепления крупных молекул ФТК-пептидов и белков является методика Френкель-Конрата [ПО, 114]. По этой методике с целью устранения трудностей, связанных с нерастворимостью указанных соединений, все реакции проводятся на полоске бумаги, что обеспечивает доступ летучих реагентов к большой поверхности белка.

Циклизация осуществляется в парах смеси 6 н. HCl и ледяной уксусной кислоты ори комнатной температуре в течение 4—16 час. Все ФТГ-производные можно экстрагировать из бумаги, но ФТГ-производное полуцистина, если оно образуется, остается соединенным с пептидной цепью. Выходы фенилтиогидантоинов на последовательных стадиях расщеп-

16*

244

Селективное расщепление белков

ления обычно высоки и в среднем составляют около 80% (по данным измерения максимальной оптической плотности). Однако имеются сообщения [121], что выходы являются более низкими, если они определяются по выделенным соединениям.

Наиболее успешное применение этот метод нашел для определения последовательности расположения аминокислот гепта пептидного участка Н.Сер.Тир.Сер.Мет.Глу.Гис.Фе— в кортикотропине овцы [141], декапептидного участка Н. Асп.Глу.Гли.Про.Тир.Лиз.Мет.Глу.Гис.Фе— в меланофорости-мулирующем гормоне [120, 142] и пентапептидного участка Н.Тре.Про.Вал.Тре.Про— в пролактине [63].

Другой метод, основанный на использовании безводной трифторуксусной кислоты [100], которая очень хорошо растворяет белки [173], успешно применялся для циклизации (5 мин при 0°) ФТК-производных при последовательном расщеплении в пепсине участка Н.Илей.Глу.Асп.Глу— [90]. Этот метод можно применять также для обработки ФТК-производных других белков. Вследствие быстрого образования промежуточного реакционноспособного тиазолинона (см. схему на стр. 239), по-видимому, это соединение лучше экстрагировать после кратковременного проведения реакции и завершить циклизацию в Зн. HCl, которая не разрушает ФТГ-производ-ных серина и треонина. Представляет интерес тот факт, что очень низкие выходы, полученные Шефердом и сотр. [284] при тщательном изучении расщепления пептидов из кортикотропина, обусловлены потерями (50—70%) на стадии циклизации в среде ледяная уксусная кислота — HCl при 75—80° в течение 15 мин. Поскольку тиазолинон образуется быстро и имеет высокую реакционную способность, подобные условия циклизации являются, по-видимому, рлишком жесткими. На основании экспериментальных результатов этих авторов можно предположить, что критическая фаза разложения наблюдается во время расщепления и циклизации или одного из этих процессов, так как в более мягких условиях выход аминокислот при регенерации из ФТК-пептидов оказался ниже, чем выход аминокислоты из ФТГ-производного аланина в аналогичных условиях. Этим можно объяснить, почему некоторые исследователи [108, 151, 242] предпочитают пользоваться методом вычитания, согласно которому N-концевая аминокислота обнаруживается по ее исчезновению. Несмотря на низкие выходы и случайное расщепление связей, Шеферду и сотр. [284] удалось обнаружить N-концевой остаток, так как его количество обычно в 5—10 раз превышает содержание других аминокислот в реакционной смеси. Однако в случае неустойчивой, неэкстрагируемой или встречающейся в пеп*
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed