Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Реагенты, селективно отщепляющие Концевые остатки 245
тиднои цепи несколько раз аминокислоты низкие выходы не являются надежным критерием и могут привести к неправильным выводам.
Другие методы. Замещенные о-нитрофенильные соединения вводят в свободную аминогруппу действием соответствующего фторпроизводного. Последующее восстановление нитро-группы позволяет легко осуществить циклизацию аминосо-единения в лактам в мягких условиях. Р. Холли и А. Хол-ли [156] при разработке этого метода исследования простых пептидов применяли 1-фтор-2-нитро-4-карбометоксибензол, но другие исследователи [162, 169] предпочитали работать с более доступным 1-фтор-2,4-динитробензолом. Реакции при ступенчатом расщеплении по методу Р. Холли и А. Холли [156] протекают по следующей схеме:
F4^ ,NOj CHR—CONHCHR'CO— ' '
<Q> +NH5 "Н8-%
хсооснэ
CHR-CONHCHR'CO— CHR-CONHCHR'CO—
/ /
NH NO2 NH NH2
\_/ \_/
-у / S, ' H2, Pt /? V _рН4 ,
\ \
COOCH3 • COOCH3
CHR-CO
- Il
.> NH NH
\ /
S~\
5 чаг, 25°
<
+ NH2CHR'CO—
\
' . COOCH3
ОН
I
CHR-C I Il NH N
\_/ .
/У Ч - •
\=/ • \
COOCH3
В случае динитрофенилпептидов (ДНФ-пептиды) во избежание вторичных реакций необходимо работать в отсут-
246
Селективное расщепление белков
ствие кислорода. Продукты реакции стабилизируют динитро-фенилированием. ДНФ-Аминодиоксихиноксалины можно идентифицировать .хроматографическим методом, а N-конце-вую аминокислоту определять в виде ДНФ-производного путем гидролиза части нового ДНФ-пептида. Преимущество этого метода заключается в возможности расщепления в мягких условиях, при которых неспецифичное расщепление пептидной связи маловероятно. Однако при работе с на-тивными белковыми веществами [162, 169] до сих пор удалось получить только низкие выходы. Описано [281] дальнейшее усовершенствование метода расщепления, заключающееся в селективном восстановлении о-нитрогруппы. При этом получаются окрашенные продукты, которые более устойчивы и легко могут быть идентифицированы хроматографированием на бумаге. Подробно применение этого метода расщепления к пептидам еще не описано.
Методы определения С-концевых остатков
Расщепление изотиоцианатами. Превращение С-концевого остатка в ацилизотиоцианат XXI облегчает самопроизвольную циклизацию в ацилтиогидантоин XXII [273].
—NHCHRCONHCHR'COOH + HCNS —> —NHCHRCONH—CHR' —>
I
S=C со XXi
__> —NHCHRCON—CHR' -^—> —NHCHRCOO-+ NH-CHR' II Il
S=C CO S=C со
\ / • ••• \/
NH •NH
XXII - ¦ . XXIII
. • . " 5-Замещенный
2-тиогидантоин
Тиоциановую кислоту обычно получают, действуя уксусным ангидридом (который блокирует N-концевую группу) на тиоциан'ат аммония. Конденсация происходит при кратковременном осторожном нагревании [19, 301]. Смешанные ангидриды тиоциановой и других кислот [177, 302], например (CeH5O)2PONCS [177], обеспечивают более мягкие условия проведения реакции.
5-Замещенный 2-тиогидантоин (XXIII) легко дезацили-руется разбавленными щелочами, например, 0,01 н. раствором
Реагенты, селективно отщепляющие концевые остатки
247
NaOH [177] или кислотами [301]; дезацилирование можно контролировать спектрофотометрически [177, 181].
Тиогидантоины удается идентифицировать хроматографи-рованием на бумаге [68, 94] или путем регенерации из них аминокислоты [19], как это описано выше для фенилтиогидан-тоинов, полученных по методу Эдмана (см. стр. 237—245).
Эта реакция не пригодна для отщепления С-концевых остатков пролина, так как они не образуют тиогидантоин, остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, которые образуют циклические ангидриды, а не тиогидантоины (аспарагин и глутамин, наоборот, дают тиогидантоины [301]), а также остатков серина, треонина, цистина, аргинина и лизина [19, 301], которые неустойчивы при циклизации или регенерации аминокислоты из тиогидантоинового производного. Таким образом, этот метод находит весьма ограниченное применение для прямого определения строения пептидов и белков. Для определения С-концевого остатка по разности [107] реакция может оказаться более полезной, но ее все же нельзя использовать для определения аспарагиновой и глутаминовой кислот и пролина. Однако путем микробиологического анализа [107], специфичного для остатков /-аминокислот, эти аминокислоты могут быть определены по потере оптической активности на 50% вследствие рацемизации в том случае, когда они являются С-концевыми.
Этерификация, восстановление и миграция ацильной группы С-концевых остатков. Предложена [15, 65] представляющая интерес схема последовательного отщепления С-концевых остатков путем этерификации и восстановления карбоксильной группы гидридом металла. Миграция ацильной группы от N к О в продукте восстановления XXIV дает С-кон-цевой остаток с легко гидролизующейся сложноэфирной, а не пептидной связью (XXV). Дальнейшее восстановление приводит к его отщеплению в виде ?-аминоспирта XXVII, в результате чего у пептида появляется С-концевой ?-оксиамидный остаток XXVI, способный к ацильной перегруппировке [14]. Описанный процесс можно проводить повторно.
