Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
ственно. Последовательная обработка in vitro субстрата MEcoR II и MMva I приводит к образованию №,5-диметилци-тозина [103]. Таким образом MMva I оказалась нечувствительной к метилированию цитозинового остатка по 5-тому положению. Модификация по ^-положению, наоборот ингибирует MEcoR II. В другом аналогичном исследованном случае, касающемся ферментов MAlu I, MPvu II (и ее изаметимера MCfr6 I), узнающих соответственно 5'AGCT (образуется т5С) и 5'CAGCTG (образуется ш4С) имела место ингибиция последующего альтернативного метилирования по этому же цитозиново-му остатку [102].
Как следует из данных представленных в табл 18, аналогично реагирует на модификацию субстрата MBainH I.
4.5. Практическое применение сведений о различных
проявлениях субстратной специфичности рестриктаз
Сведения о различных проявлениях субстратной специфичности рестриктаз, наряду с их теоретической значимостью, имеют большое практическое значение — являются предпосылкой для целенаправленного использования этих ферментов в различных отраслях их применения в качестве аналитических реагентов. В первую очередь это замечание относится к изучению специфики метилирования эукариотической ДНК- В этой ДНК в качестве минорного основания присутствует 5-метилцитозин [46, 129]. Подавляющее его большинство содержится в составе CG-динуклеотида [46, 129]. Именно использование рестриктаз, чувствительных к метилированию цитозина, впервые открыло возможность изучать вышеуказанный вопрос [124, 129, 379, 416].
Интересным практическим приложением чувствительности рестриктаз к метилированию является создание при его помощи новых вариантов фрагментирования субстрата [274]. Этот метод заключается в модификации ДНК сайт-специфической метила-зой, узнаваемый участок которой частично перекрывается с таковым рестриктазы, при помощи которой предполагается расщеплять субстрат. Таким приемом можно изменить частоту расщепления субстратной ДНК- Например, рестриктаза Nhe I способна расщеплять ДНК аденовируса-2 в четырех местах, содержащих последовательность 5'GCTAGC. Метилирование этой ДНК при помощи метилазы Alu I, модифицирующей цитозино-вый остаток в последовательности 5,'AGmCT [25], в перекрывающихся участках (5'AGmCTAGC) делает устойчивой к действию Nhe I последовательность 5'GCTAGC [274]. Вследствие этого Nhe I расщепляет ДНК аденовируса-2 только в одном участке [274]. Таким образом in vitro можно достичь совершенно нового варианта фрагментирования ДНК, неосуществимого ни одной известной рестриктазой.
Набор имеющихся рестриктаз и метилаз в настоящее время позволяет получать десятки вариантов фрагментации ДНК [22, 274]. Особенно следует выделить работы, направленные на разработку методов мегабазового картирования ДНК, так как ассортимент прототипов с более чем семичленньши узнаваемыми участками пока ограничен несколькими наименованиями. Для увеличения специфичности предлагается комбинация мети-лазы, образующей т6А в участках, перекрывающихся с последовательностью узнаваемой RDpn I — Gm6ATC. Так, совместное применение этого фермента с MTaq I, узнающей тетрануклеотид S'TCG^A и метилирующей в нем аденин дает расщепление 8-ми звенных участков 5'TCGmATCGA а комбинация
3'AGC TmAGCT
с MMbo II (GAAGm6A) к декануклеотидному сайту 5'GAAGmA ТСТТС З'СТТС TmAGAAG [256].
Недавно предложен подход получения 10—14-тинуклеотидного «узнавания» при помощи двух метилаз и рестриктазы [257]. Он основан на чувствительности метилаз к определенным вариантам неканонического метилирования. Например, в случае наличия последовательности 5'CCGGATCCGG, представляющей собой участок узнаваемый RMBamH I (5'GGATCC), перекрытый с обеих сторон сайтами МНра II (5'CCGG), метилирование ДНК метилазой Hpa II приводит к модификации крайних цитозинов сайта BainH I:
5'CmC GGATCmC GG
3'G GmCCTAG GmCC
Такая модификация защищает узнаваемый участок от действия МВашН I, в то время как все другие участки ДНК 5'GGATCC метилируются этой метилазой по внутреннему цитозину и защищаются от действия RBamH I. Последующая обработка ДНК препаратом RBamH I приводит к расщеплению по указанным 10-ти звенным сайтам, так как рестриктаза нечувствительна к модификации внешних цитозиновых остатков [257].
Место расщепления субстрата не играет роли п.ри физическом картировании ДНК. Но существует ряд задач, для которых структура концов имеет вполне определенное значение. Фрагменты с выступающим З'-концом могут быть удлинены с помощью терминальной трансферазы [326]. Это находит применение в опытах по клонированию ДНК [187]. Наличе липких концов облегчает получение рекомбинантных ДНК in vitro. Однако рекомбинанты можно получать только с фрагментами, образованными действием на субстрат одной и той же рестриктазы или рестриктаз, узнающих различающиеся последовательности, но образующих идентичные липкие концы. Примерам может быть пара рестриктаз BamH I и Sau3A I, узнающих соот-
ветственно 5'G*GATCC [374] и 5'*GATC [362] и расщепляющих их в местах указанных стрелками.
С практической точки зрения представляют интерес альтернативные прототипы, различающиеся по месту расщепления субстрата, расширяющие потенциальные возможности проведения экспериментов. Например, при получении рекомбинантных молекул ДНК использование рестриктазы, дающей тупые концы вместо липких, позволяет клонировать по этому сайту вектора любые тупоконечные фрагменты.
