Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
4.4.4. Чувствительность изошизомеров к местоположению метилированного основания
Изошизомеры могут отличаться по чувствительности в отношении местоположения метилированного основания в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Среди исследованных в этом аспекте ферментов удалось выявить 15 пар ферментов по разному реагирующих на метилирование одного и того же основания в узнаваемом участке (табл. 13; в таблице не приведены ферменты-изошизомеры, обладающие такой же чувствительностью к модификациям субстрата). Кроме того рестриктазы Sau3A I, Mbo I и Dpn I различаются не только по чувствительности к модификации аденина в узнаваемом участке 5'Gm6ATC, но в случае Dpn I именно только такой (модифицированный) субстрат и расщепляется этим ферментом.
Изошизомеры, отличающиеся по чувствительности к идентичной _____________________модификации субстрата______________________________
№ Метилированный Расщепляет® He расщепляет®
сайт3
1. Cm5CGG Msp I Нра II
2. Cm4CGG Msp I Нра II
3. CCm5CGGG Xma I Sma I
4. Cm5CWGG BstN I EcoR II
5. Gm6ATC Sau3A I (Dpn I)* Mbo I
6. GATm5C Mbo I Sau3A I
7. GATm4C Mbo I SauSA I
8. GGTACm5C Kpn I Asp718 I
9. GGTAm5Cm5C Kpn I Asp718 I
Ю. GGWCm5C Afl I Ava И
11. RGm6ATCY Xho 11 Mfl 1
12. Tm4XGGA Acc III BspM 11
13. TCm5CGGA Acc III BspM II
14. TCCCGGm6A BspM II Acc III
15. TCGCGm6A Sbol3 I Nru I
а — ом. пункт «а» примечаний к табл. 12. б — фермент классифицируется нечувствительным к метилированию, если скорость расщепления метилированного сайта снижается ие более, чем в 10 раз по сравнению со скоростью расщепления иеметилироваиной последовательности. Если метилирование вызывает более чем 20-ти кратную ингибидию фермента по сравнению с неме-тилированным субстратом, то1 фермент считается чувствительным к метилированию.
* Dpn I расщепляет только метилированный субстрат.
4.4.5. Чувствительность рестриктаз
к mSCG и mbCNG метилированию субстрата
Эукариотическая ДНК животного и растительного происхождения содержит т5С в основном в составе CG динуклеотида. Кроме того значительная его часть в растительной ДНК может находиться в CNG последовательностях. Поэтому сведения о чувствительности рестриктаз, узнаваемые участки которых содержат эти элементы, к их метилированию представляют большой интерес. Эти данные представлены в табл. 14 и 15.
4.4.6. Чувствительность рестриктаз
к dam и dcm зависимому метилированию
Немаловажное практическое значение имеет сведения о чувствительности рестриктаз к метилированию, осуществляемому в Е. coli dam и dcm метилазами [101, 168, 243, 247]. Эти метилазы содержатся в большинстве штаммов Е. coli, используемых для получения различных как природных, так и рекомбинантных молекул ДНК (фаги, плазмиды). Поэтому они оказываются частично или полностью метилированными в следующих участках: 5'Gm6ATC [168] (dam — зависимое метилирование) и 5'Cm5C(A/T)GG [101, 247] (dcm — зависимое метилирование).
Рестриктазы, нечувствительные к метилированию CG и CNG, находящихся в составе узнаваемого участка или частично перекрывающихся с нима
m6CG входит в сайт СО может частич m5CNG входит ra CNG может час
узнавания® но перекрываться в сайт узиаваиия3 тично перекрываться
с узнаваемым с узнаваемым
сайтом® сайтом3
Асс 111 Afl I (GGWCC) Aac II (CCWGG) Afl I (GGWCC)
(TCCGAA) BamH I Асс III BstE II
Asu II (TTCGAA) (GGATCC) (TCCGGA) (GGTNACC)
Ban I (GGCGCC) Bst I (GGATCC) Ару I (CCWGG) EcoR V
Cfr9 I (CCCGGG) BstE I(GGTNACC) Ava I (CCCGGG) (GATATC)
Msp I (CCGG) EcoR V (GATATC) BspN I (CCWGG) Fok I (CATCC)
Taq I (TCGA) Fok I (CATCC) BstN I (CCWGG) Hinc II (GTYRAC)
TthHB I (TCGA) Hae III (GGCC) Cfr9 I (CCCGGG) Hinf I (GANTC)
Xma-I (CCCGGG) Hinc II (GAYRAC) Xma I (CCCGGG) Hpa I (GTTAAC)
a --- ом. пункт «а Hinf I (CANTC) Mva I (CCWGG) Mboi II (TCTTC)
довательность нук Hpa I (GTTAAC) TaqX I (CCWGG) Kpn I (GGTACC)
входящие в соста! Крп I (GGTACC) >л. 12. б --- в скобка x приведена после-
действию данной р Mbo II (ГСТТС) ая данной рестрик тазой. Цитозины,
Рестриктазы, чувс » примечаний к та? угилирование котор! jx не препятствует
