Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Защита ДНК от действия рестриктаз может происходить вследствии ее модификации другими метилазами, узнаваемые последовательности которых полностью или частично перекрываются с субстратным участком исследуемых рестриктаз. Инте-
pec представляют те случаи, когда такое метилирование затрагивает другие нуклеотиды, немодифицируемые канонической метилазой. Рестриктазы различаются по чувствительности к такому типу модификации субстрата. Защита ДНК от действия некоторых рестриктаз может происходить вследствии метилирования только определенного нуклеотида в узнаваемой последовательности. Например, BamH I расщепляет последовательности 5'GGATCmC [238, 274] и 5'GGmATCC [98, 125], но не действует на 5'GGATmCC [169]. Последний вариант метилирования узнаваемого участка соответствует каноническому. В отличие от приведенного примера существуют также рестриктазы, ингибируемые метилированием нескольких различных оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Например, рестриктазы Xho I и SalG I, узнающие последовательности 5'CTCGAG [145] и 5'GTCGAC [66] соответственно, не расщепляют субстрат, содержащий в вышеуказанных последовательностях метилированный аденин или внутренний цитозин [129, 254].
Обсуждая влияние сайт-специфического метилирования в неканонических положениях узнаваемого участка следует иметь ввиду, что ингибирующее действие на рестриктазы не всегда проявляется по принципу «да» или «нет» [105, 258]. Иногда наблюдается только снижение активности фермента в 5—20 раз [152, 274]. В таких случаях конечный результат может зависеть от условий проведения реакции, времени ее протекания, концентрации фермента. Возможно этим следует объяснить, например, противоречивые данные о том, что RXma I расщепляла 5'CCm5CGGG последовательность в эукариотической ДНК, но не в ДНК Н. parainfluenzae [98, 415, 416].
4.4.2. Чувствительность рестриктаз к природе минорного основания
До недавнего времени специфичность рестриктаз к модификации субстрата изучалась только в отношении местоположения 1Модифицированного основания в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Открытие Ы4-метилцитозина (т4С) [56, 103, 191] поставило вопрос о способности рестриктаз дифференцировать два по разному модифицированные цитозина (N4- и 5-метилцитозин), локализованные в идентичных местах узнаваемой последовательности нуклеотидов. Такие исследования впервые были проведены на примере рестриктаз Mva I и EcoR II, узнающих 5'CC(A/T)GG последовательность. Метилирование внутреннего цитозина в указанном участке по 5-тому положению (образуется 5-метилцитозин) защитило субстрат от действия EcoR II, но не от Mva I [103]. В случае появления в этом же месте №-метилцитозина ДНК становилась устойчивой кдей-
ствию обеих исследуемых рестриктаз. Сказанное иллюстрируется схемой, которая приводится ниже.
RMval REcoR Л
RMval
REcoRU
ММ val
СтЧС(АП)Бб
RECORD
CC(A/T)GG
*
Ст5С(А/Т)ев
MEcoRU
RMva I
(перечеркнутой стрелкой обозначено отсутствие действия фермента) .
Оказалось, что аналогичным свойством в отношении некоторых положений участка узнавания обладают также рестриктазы Xma I, Cfr9 I, Sma I, Нра II [105], Ben [191] и предположительно BstN I [258]. Эти данные указывают на больший блокирующий эффект т4С по сравнению с т5С, так как известна лишь одна рестриктаза, способная расщеплять сайт при наличии m4C — Msp I [105]. Целая группа ферментов блокируется при наличии метилированных цитозинов любой природы в идентичных положениях узнаваемого участка [102, 103, 105]. Таким образом эти ферменты оказались неспособными дифференцировать ш5С и т4С.
Выше были рассмотрены общие вопросы, касающиеся проявлений специфичности рестриктаз по отношению к природным модификациям субстрата. Ниже излагаются сводные данные и некоторые следующие из них частные обобщения.
4.4.3. Сводные данные о чувствительности рестриктаз к модификациям субстрата
Чувствительность рестриктаз к различным модификациям субстрата представляет собой важное проявление их специфичности. Поэтому такие данные регулярно обобщаются и публикуются. Выполняется эта работа в основном Макклелландом [252, 253, 258]. В табл. 12 представлены сводные данные, касающиеся характеристики ферментов рестрикции II типа [258]. Они обобщают совокупность известных данных о чувствительности рестриктаз к метилированию субстрата. Ниже приводятся некоторые частные обобщения, составленные на основе данных, приведенных в табл. 12.
4-5933
49
Чувствительность эндонуклеаз рестрикции к метилированию субстрата
Узнаваемая Расщепляемые Нерасщепляемые
Рестриктаза последовательность последовательности последовательности
AacI CCWGG Cm5CWGG ?
