Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
чувствительности специфических эндонуклеаз к 5-гидроксиме-тилцитозину также стали приводиться в сводных таблицах, характеризующих влияние различных природных модификаций субстрата на его подверженность расщеплению ферментами рестрикции (см. разд. 4.4.2). Влияние других необычных природных модификаций фаговых ДНК (замещение тимина иа 5-гидроксиметилурацил — фаги В. subtilis SPOl, SP8 и др., на урацил — фаги PBS1 и PBS2, на 5-дигидроксипентилурацил, который подвергается пострепликативному глюкозилированию, фосфоглюконированию и т. д.) [198, 214, 366] на способность рестриктаз расщеплять такие субстраты мало изучено. На основе проведенных исследований делаются выводы о резистентности обсуждаемых субстратов к действию подавляющего большинства исследованных рестриктаз [182].
Особое место среди всех исследованных рестриктаз занимает Dpn I, которая расщепляет ДНК только при наличии 6-метил-аденина в обоих цепях узнаваемой последовательности 5'Gm6 АТС [218, 219]. Немодифицированная или гемиметилиро-ванная (содержащая одну метилированную, другую неметили-рованную нить) ДНК устойчива к действию этого фермента [380]. В настоящее время обнаружены еще б рестриктаз, характеризующиеся идентичной с Dpn I субстратной специфичностью как в отношении узнаваемой последовательности, так и ее модификации— Cfu I, NmuE I, NsuD I, Nan II, NgoIII, NmuD I [319].
В литературе имеются данные, что Ару I преимущественно расщепляет ДНК в том случае, когда в ее узнаваемой последовательности 5'CC(A/T)GG цитозиновый остаток, расположенный рядом со средним основанием является метилированным [304]. «Преимущественно» означает тот факт, что и неметилиро-ванная последовательность подвергается (хотя и очень слабому) расщеплению этим ферментом.
Вполне вероятно, что существует и больше аналогичных эндонуклеаз, но отличающихся от рассмотренных структурой узнаваемого участка. Их обнаружению может препятствовать использование в качестве субстратов ДНК вирусов и плазмид, размноженных в штаммах Е. coli, характеризующихся содержанием ограниченного круга метилаз (dam — узнает 5'GATC и dcm — 5'CC(A/T)GG). Поэтому для поиска таких ферментов следовало бы разработать специальные методические подходы.
Возможно совершенно новый вариант специфичности скрывается за феноменом рестрикции фагов у микоплазмы Achole-plasma landlawii JAl [349]. Этот штамм ограничивал фаги, содержащие 5-метилцитозин в любом окружении. Таким образом эта система рестрикции проявляет специфичность к т5С, а не к какой-то определенной последовательности нуклеотидов, содержащей это минорное основание. Вопрос о том, имеется ли в клетках эндонуклеаза специфически расщепляющая ДНК, со-
держащую m5C пока не исследован. Обсуждаемое явление в*, какой то мере феноменологически напоминает элиминацию из клеток некоторых штаммов Е. coli ДНК, содержащей метилированные основания [303]. Однако, в последнем случае идентифицированные системы рестрикции (МсгА, МсгВ и Мгг) проявляют специфичность к ближайшему соседу минорного основания, чего не наблюдается у A. landlawii. Пока для Е. coli также не продемонстрировано, что наблюдаемый феномен обусловлен наличием в клетках специфических эндонуклеаз.
4.4.1. Специфичность рестриктаз по отношению к, местоположению модифицированного основания
Рестриктазы проявляют специфичность и по отношению к •местоположению модифицированных оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Во всех исследованных случаях было обнаружено, что метилирование, осуществляемое штаммо-специфической метилазой, защищает ДНК от расщепления сопряженной рестриктазой [98, 252, 319]. Этот тип модификации Макклеландом [252] был назван «врожденным» («cognate»). В настоящем обзоре для его обозначения будет принято название — каноническое метилирование. Оно проявляется в метилировании симметрично расположенных строго определенных оснований в каждой цепи узнаваемой последовательности нуклеотидов. Например, специфическая метилаза Hpa II метилирует внутренний цитозин в последовательности 5'CmC GG в
3'G GmCC
результате чего ДНК становится устойчивой к действию рестриктазы Hpa II [238, 302].
Показано, что для защиты субстрата достаточным является наличие минорного основания только в одной из цепей в узнаваемой последовательности нуклеотидов [329, 380], т. е. в этих случаях не наблюдалось фрагментирования ДНК. Вместе с тем имеются данные о том, что некоторые рестриктазы в случае гибридного дуплекса ДНК, содержащего одну метилированную, другую неметилированную нить, способны надрезать немоди-фицированную цепь [94, 105, 210, 358]. Скорость расщепления немодифицированной нити в гемиметилированной ДНК является ниже, чем при расщеплении двухнитевого немодифицированно-го субстрата [358]. Исключением во всех отношениях является RMsp I, расщепляющая канонически гемиметилированную узнаваемую последовательность 5/mCCGG [105]. Кроме того метили-
3' GGCC
рованная цепь расщеплялась быстрее, чем немодифицированная.
