Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Вариация характера расщепления участков узнавания внесла некоторые поправки и в понятие изошизомерии. Были выявлены рестриктазы, узнающие идентичные последовательности, но различающиеся по месту их расщепления. Например, рестриктазы Sma I и Xma I узнают одинаковые последовательности нуклеотидов, но первая из них при разрыве ДНК образует фрагменты с тупыми концами [319], а вторая расщепляет узнаваемый участок с образованием б'-выступающих тетрануклео-тидных концов [132]. Такие изошизомеры было предложено называть ложными [49].
Думается, что для обозначения рестриктаз, узнающих одинаковые последовательности нуклеотидов, но расщепляющих их в разных местах, вполне приемлемым является термин альтернативные прототипы (alter — один из двух) [102]. Он позволяет подчеркнуть «прототипность» таких ферментов как в отношении функционального проявления, так и следующих из этого различных возможностей в случае их применения в качестве аналитических реагентов. Наличие в термине ложный изошизомер (изос — равный, схизос—расщепляю) [49] последнего слова как бы стушевывает эту разницу.
Рассмотрение литературных данных убеждает, что истинные изошизомеры встречаются чаще, чем альтернативные прототипы. Последние перечислены в табл. 11.
Таблица 11
Альтернативные прототипы рестриктаз
Узнаваемая Варианты расщепления Название фермента Источник информации
последовательность
5'---GATC 5'---+GATC Mb© I [130]
5'---GmA+TC Dpn I 138]
5'---GCGC 5'---GCG+C Hha I 3201
5'---G+CGC HinP I 3401
5---CCCGGG 5'---CCC+GGG Sma I [132, 3191
5'---C+CCGGG Xma I [132]
5'---GGCGCC 5'---GG+GGCC Nar I [319]
5'---GGCG+CC Bbe I 205]
5'---GGC+GCC Eco78 I [21]
5'---CC(A/T)GG 5'---+CC(A/T)GG EcoR II [82]
5'---CC*(A/T)GG BstN I Г319]
5'---PuGGNCC- 5'---PuG+GNCCPy Dra 11 [1221
Ру
5'---PuGGNOCPy Pss I [319]
5'---GGTACC 5'---GGTAC+C Kpn I [374]
5'---G^GTACC Asp718 I [87]
5'---GAGCTC 5'---GAGCT+C Sac I [319]
5'---GAGiCTC Ecll36 II 319]
5'---CCNGG 5'---CCWGG ScrF I 1351
5'---^CCNGG Sso II [36, 50]
5'CTCGAG 5'---C*TCGAG Xho I [145]
5'---CTOGAG Sci I [319]
Расщепление ДНК некоторыми рестриктазами, узнающими: разорванные палиндромные последовательности (см. табл. 8„ типы 15—16), происходит в области, разделяющей симметричные части узнаваемой последовательности. Например, рестрик-таза Sfi I [301] расщепляет ДНК следующим образом: 5'-GGCCNNNN*NGGCC З'-CCGGN+NNNNCCGG
В настоящее время также известны 43 рестриктазы, которые расщепляют ДНК за пределами узнаваемых участков. Все они.
(за исключением Gsu I, Fsf I, Gdi II, Pie I, Bbv I и его изошизо. мера AlwXI) узнают несимметричные последовательности нуклеотидов (табл. 8, типы 33—36). Расстояние точки разрыва от узнаваемого участка, а также ее ориентация являются строго определенными для каждой рестриктазы. Например, рестрикта-за Fok I [359] расщепляет ДНК с одной стороны узнаваемой последовательности на расстоянии в разных цепях, равном 9 и 13 нуклеотидов:
5'-GGATGNNNNNNNNN+
3'-CCTATNNNNNNNNNNNNN+
Как в отношении типа построения узнаваемого участка, так и характера расщепления субстрата, обсуждаемые ферменты напоминают рестриктазы III типа (см. табл. 1). Только в отличии от последних, специфические эндонуклеазы дают исчерпывающее фрагментирование субстрата по всем узнаваемым участкам.
4.4. Специфичность рестриктаз в отношении природных модификаций основания
Метилирование оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов способно предотвратить ее расщепление рестриктазой. Такая модификация субстрата осуществляется метилаза-ми и лежит в основе механизма защиты клеточной ДНК от сопряженной специфической эндонуклеазы.
Долгое время было общепринятым мнение, что модификации в составе ДНК подвергаются только аденин и цитозин с образованием 6-метиладенина (т6А) и 5-метилцитозииа (т5С)
[126, 129, 252]. В последнее время появились данные о существовании специфических метилаз, способных метилировать гуа-ниновые остатки по 7-му положению [278, 279] и цитозин по N4-положению (тЛС) [56, 103, 191], и продемонстрировано их участие в защите ДНК от действия рестриктаз. Последующие исследования раскрыли широкую таксономическую распространенность ДНК-[Н4-цитозин]-метилтрансфераз [56, 103, 191], а также т4С [128, 130] среди бактерий, что позволяет считать т4С наряду с упомянутыми т5С и т6А обычным минорным компонентом бактериальной ДНК. В настоящее время чувствительность рестриктаз рассматривается в отношении упомянутых трех типов метилирования ДНК [258]. Кроме того представляют интерес и другие природные модификации ДНК. Имеются в виду «необычные» основания, которые включаются в состав ДНК в ходе репликации. К таким относится 5-гидроксиметилцитозин, замещающий все цитозиновые остатки в геноме Т-четных и некоторых других фагов [37, 230, 402]. Эти 5-гидроксиметилцитозино-вые остатки кроме того подвергаются глюкозилированию. ДНК, содержащая 5-гидроксиметилцитозин, является устойчивой к действию большинства рестриктаз. В последнее время данные о
