Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Исследования субстратной специфичности рестриктаз в условиях, обеспечивающих ее изменение, позволили определить, что в этом случае ферменты узнают наборы близких по структуре участков ДНК, являющихся производными канонической узнаваемой последовательности нуклеотидов [112, 141, 170, 297, 346, 397]. Примеры таких «наборов» представлены в табл. 10. Последовательности, производные канонических, расщепляются с неодинаковой скоростью. В случае EcoR I* активности наблюдается следующая градация скоростей расщепления: 5'GAATTC (каноническая) >GGATTT>AAATTT>AAATTC, ТААТТС [397].
Структура узнаваемых участков, служащих субстратом в случае релаксированной специфичности
Фермент Каноничес Релаксированная узнаваемая последовательность Источ
кая узна ник ин
ваемая форма
последова ции
тельность
XYZZ’Y’X’ NVZZ’- XNZZ’Y’X’ XYNZ’Y’X’ XNZZ’Y’N NYZZ’-
Y’x’a) V’N
Hind III A AGCTT GAGCTC AGGCTT AATCTT [273]
ATGCTT
Pvu II CAO CTO CCGCTG CATCTG [2721
CACCTG
EcoR V OAT АТС AATATC GGTATC GACATC [1631
TATATC GCTATC GAAATC
CATATC GTTATC GAGATC 6>
BamH I G GATCC CGATCC GAATCC [209]
AGATCC
TGATCC
BaraH I G GATCC GAATCC GGCTCC [141]
GGGTCC
GGTTCC
EcoR I G AATTC AAATTC GGATTT AAA- [397]
TAATTC TTT
CAATTC
а) — типы построения узнаваемых участков; X и Y — нуклеотиды определенной структуры; X и X', Y и Y' и т. д. — комплементарные нуклеотиды; N— любой нуклеотид;
б) — EcoR V* расщепляет данную последовательность, только в случае ¦отсутствия dam специфического метилирования (5'Gm6ATC)
Повсеместно распространено мнение, что обсуждаемое явление обусловлено действием факторов инкубационной среды, влияющих на точность узнавания субстрата рестриктазами, а не наличием в исследуемых препаратах разных по специфичности ферментов. В пользу этого вывода говорят данные, полученные с использованием гомогенных препаратов рестриктаз [112, 140, 170], совместное хроматографическое фракционирование «строгой» и «ослабленной» активностей [373] и аналогичное действие различных факторов (глицерин, органические растворители, ионы марганца и т. д.) на эндонуклеазы, обладающие различной субстратной специфичностью [112, 140, 170, 181, 236, 297, 397].
Способность рестриктаз проявить пониженную субстратную специфичность изучена на небольшом числе примеров. Не исключено, что эта особенность характерна для многих (если не всех) специфических эндонуклеаз.
4.3. Место расщепления субстрата
Важным функциональным проявлением рестриктаз является место расщепления ДНК в отношении узнаваемого участка. Это свойство также характеризуется большим разнообразием вариантов. Большинство специфических эндонуклеаз расщепляют ДНК внутри участка узнавания. Возможные варианты расщепления можно рассмотреть на примере гексануклеотидных палиндромов:
Рестриктаза Узнаваемая Структура концов Источник
последов ательиость информации
Xma I 5---CICCGGG 5' --- выступающий Г132]
Asu II 5'---TT|CGAA тетр*ануклеотндный [120]
5' ---выступающий
Sma I 5---CCCIGGG динуклеотидный [319]
Полностью
Pvu I 5'CGAT|CG спареииый Г144]
3' --- выступающий
Kpn I 5'---GGTAG|C динуклеотидный [374]
3' --- выступающий
тетрануклеотидный
Таким образом, при расщеплении двухнитевой ДНК могут образоваться концы трех структурных типов. Если разрыв происходит посредине узнаваемой последовательности, то образуются фрагменты с полностью спаренными («тупыми») концами. В тех случаях, когда расщепление ДНК происходит в стороне от оси симметрии, образуются выступающие однонитевые концы, получившие название «липких», т. е. способных спариваться с комплементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате ее разрыва. При расщеплении одними рестриктазами образуются фрагменты с 5'-выступаю-щими липкими концами. Другие рестриктазы дают фрагменты с З'-избыточностью. Число нуклеотидов в однонитевом конце может варьировать от 5-ти — EcoR II [82], до одного ScrF I [135].
