Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Интересные возможности представляют рестриктазы, узнающие определенную последовательность нуклеотидов, но дающие разрыв в стороне с образованием выступающих концов. Эти ферменты были отнесены к I IS типу [364]. Если таким ферментом разрезать ДНК, то при действии лигазы in vitro она соберется в первоначальную структуру. Таким образом, можно ре-синтезировать в пробирке небольшой геном или его отдельные части [49].
Благодаря работам Подхайской и Шибальского [296, 364], способность рестриктаз IIS типа расщеплять в стороне от узнаваемого участка нашла оригинальное применение для расщепления однонитевой ДНК в любом предетерминированном сайте. Впервые это было продемонстрировано на примере RFok I [296]. Это подход реализуется таким образом, что синтезируется олигонуклеотид, содержащий в одном конце самокомплемен-тарные последовательности, которые после спаривания образуют участок узнаваемый RFok I. Структура другого конца подбирается таким образом, чтобы она была комплементарной к участку исследуемой однонитевой ДНК в том месте, где планируется провести ее расщепление. После гибридизации синтетического олигонуклеотида с ДНК образуется двухнитевая структура, содержащая сайт узнаваемый RFok I и следующий за ним участок исследуемой ДНК. Обработка такого комплекса ферментом дает расщепление субстрата в выбранном месте.
В настоящее время, как уже отмечалось, известны 143 прототипа рестриктаз. Таким образом, имеется возможность расщеплять ДНК по 143 различающимся по структуре участкам. В конкретных экспериментах весь этот набор конечно не используется. Вместе с тем успешное решение таких задач, как физическое картирование различных ДНК, выделение их фрагментов, определение нуклеотидной последовательности, разрыв ДНК в желаемом месте (например, сразу за структурной частью гена) во многом зависит от возможностей, представленных существующими вариантами субстратной специфичности рестриктаз. Учитывая большое структурное разнообразие ДНК очевидно, что имеющийся набор этих ферментов еще далек от удовлетворения всех нужд научных исследований. Поэтому поиск рестриктаз, обладающих способностью специфически расщеплять ДНК в ранее недоступных для этого местах, не теряет
актуальности. Актуальным является и выявление альтернативных прототипов — ферментов, узнающих одинаковые последовательности нуклеотидов, но расщепляющих их в разных местах или рестриктаз по разному чувствительных к характеру метилирования субстрат. За их счет число «прототипностей», характерных для известных рестриктаз, достигает 166. В это-число входит 143 прототипов по узнаваемой последовательности нуклеотидов, 10 альтернативных по месту расщепления и 13 — по чувствительности к метилированию. С практической точки зрения это означает, что имеется 166 возможностей различного исхода воздействия рестриктаз на субстрат.
5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕСТРИКЦИОННЫХ ЭНДОНУКЛЕАЗ
Основным требованием при использовании рестриктаз в генно-инженерных и других молекулярно-генетических экспериментах является функциональная чистота, а именно, отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Поэтому, основные усилия при выделении и очистке рестрикционных эндонуклеаз направлены на получение функционально чистых их препаратов. Однако, для структурно-кинетических исследований эндонуклеаз рестрикции требуются относительно большие количества гомогенных препаратов ферментов. Несмотря на то, что как уже отмечалось, в настоящее время охарактеризовано (и в большинстве случаев выделено) более 1000 рестриктаз, лишь небольшая их часть получена в гомогенном состоянии.
Физико-химические свойства гомогенных препаратов рестриктаз в настоящее время изучены недостаточно (исключение составляет только рестриктаза EcoR I) и в большинстве случаев ограничены определением молекулярной массы методами гель-фильтрации и электрофореза. В таблице 19 приведены некоторые физико-химические свойства гомогенных препаратов рестриктаз.
Как видно из таблицы 19, большинство эндонуклеаз рестрикции П-го типа представляют собой белки, построенные из одной или нескольких идентичных полипептидных цепей, с относительно небольшой молекулярной массой, что, конечно, является определенным достоинством при структурных исследованиях. Отдельного рассмотрения заслуживает вопрос о четвертичной структуре эндонуклеаз рестрикции. Как видно из данных, представленных в табл. 19, некоторые рестриктазы, такие как Bgl I, Bsp I, Ben I, EcoR V и др., существуют в растворе в форме мономера, а для некоторых рестриктаз, таких как BamH I, EcoR I, EcoR II и ряда других, установлена субъеди-ничая организация фермента. Так для рестриктазы EcoR I было показано [266], что обычно в растворе активной формой являет -
Некоторые физико-химические свойства гомогенных препаратов эндонуклеаз рестрикции
Рестриктаза Узнаваемая Мол. масса*, Активная pi Литература
последователь дальтоны форма
ность фермента
