Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 37

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 107 >> Следующая

Следует отметить, что методы, предложенные для количественной регистрации активности рестриктаз являются методами с отбором проб в течение реакции и только в одной работе [159] был предложен непрерывный количественный метод регистрации скорости гидролиза ДНК, основанный на измерении флуоресценции при гидролизе кольцевой ДНК с интеркалированным бромистым этидием. В-третьих, для структурно-кинетических исследований рестриктаз требуются довольно большие количества, желательно, гомогенного белкового препарата фермента, что стало реальным лишь в последние годы в результате работ по клонированию генов целого ряда рестриктаз и созданию супер-продуцентных штаммов (см. разд. 5, часть II). В последние годы интерес к структурно-кинетическому изучению рестриктаз стал возрастать в связи с развитием исследований, направленных на установление механизма специфического узнавания ДНК белками, так как в этом ключе эндонуклеазы рестрикции являются исключительно интересными объектами.
6.1. Каталитические свойства рестрикционных эндонуклеаз
6.1.1. Эффективные кинетические параметры
В большинстве работ по изучению кинетических свойств эндонуклеаз рестрикции, обычно, ограничиваются лишь определением кажущихся значений кинетических параметров: кон-
станты Михаэлиса Км и каталитической константы Ккат и максимальной скорости Vm. В таблице 20 приведены кинетические параметры реакции гидролиза ДНК для ряда рестрикционных эндонуклеаз.
Несмотря на то, что кажущиеся значения Км являются мало информативными в кинетическом смысле (так как не позволяют прогнозировать механизм каталитического превращения субстрата), анализ данных, приведенных в табл. 20 позволяет сделать несколько заключений общего характера:
1) взаимодействие эндонуклеаз рестрикции с ДНК характеризуется очень низкими значениями константы Михаэлиса (в большинстве случаев порядка 10~9—10~)0 М). Несмотря на то, что константа Михаэлиса в большинстве случаев является эффективной величиной и не является истинной мерой связывания субстрата с ферментом, низкие значения этой константы отражают высокое сродство рестрикционных эндонуклеаз с ДНК;
2) максимальная скорость реакции гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции является сравнительно низкой. Так значения каталитической константы Ккат, являющейся мерой числа оборотов или каталитических актов в определенный интервал времени, находятся в интервале 0,12—8 мин-1. Таким образом
Кинетические параметры некоторых рестрикционных эндонуклеаз
Фермент KM, MxlO--- ккат мин- Субстратная Литература
ДНК
EcoR I 8 3,8 ColE I [266
EcoR I 3 8 ColE I 398
EcoR I 3 --- OolE I 399
EcoR I 0,4 1 ColE I '398
EcoR I 5 pBR322 225
EcoR I 10 1,3 I [751
EcoR I 30 1,5 SV 40 Г149]
BamH I 0,3 2,2 pJG80 176]
BamH I 0,36 ---. pJC80) 176]
BamH I 0,9 --- pJC80 175]
Hpa II --- 0,18 SV 40 ГБ 11
Bgl 11 --- 1,75 p2Hl [185]
SalQ I 0,5 0,12 pMB9 [345]
видно, что рестрикционные эндонуклеазы являются «медленными» ферментами.
Причины этого явления можно раскрыть, анализируя отношение Ккат/Км, представляющие собой кажущуюся константу скорости второго порядка для реакции между свободным ферментом и свободным субстратом. Как можно легко подсчитать из данных, приведенных в табл. 20, для ферментов EcoR I и BamH I величина значения параметра Ккат/Км лежит в области значений 107—108 М/с-1 и приближаются к лимитируемой диффузией частоте столкновения между субстратом и ферментом [327]. Таким образом, низкие значения каталитической константы скорости реакции при гидролизе ДНК, являются следствием высокоспецифичного связывания ДНК с эндонуклеазой рестрикции. С другой стороны, значения параметра Ккат/Км, приближающегося к диффузионно-лимитируемому значению указывают на то, что рестрикционные эндонуклеазы являются эволюционно совершенными ферментами, т. е. биокатализаторами, приблизившимся к пределу ускорения данной химической реакции. Следует еще раз подчеркнуть, что низкая скорость каталитического превращения ДНК эндонуклеазой рестрикции является своего рода платой за очень высокое сродство фермента к специфическим последовательностям ДНК-
6.1.2. Механизм реакции гидролиза кольцевых форм ДНК эндонуклеазами рестрикции
Изучение механизма реакции гидролиза субстрата эндонуклеазами рестрикции является одним из основных этапов исследования природы взаимодействия ДНК с этими ферментами.
Механизм реакции гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции II-типа наиболее подробно изучен для рестриктазы EcoR I. Так уже в первой работе [266], посвященной изучению физико-химических и каталитических свойств эндонуклеазы рестрикции EcoR 1, было показано, что при гидролизе кольцевой су-перспиральной формы ДНК ColE I, содержащей уникальный участок узнавания рестриктазы EcoR I, в определенных условиях наблюдается накопление промежуточного соединения реакции гидролиза плазмидной ДНК, а именно, кольцевой формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Это позволило авторам [266] предположить, что расщепление отдельных цепей двухспиральной ДНК ColE I рестриктазой EcoR I происходит не одновременно, а последовательно, и при определенных условиях возможна диссоциация фермент-субстратного комплекса — промежуточного продукта гидролиза ДНК. Количество кольцевой формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв, зависело от температуры: при температуре 0° С кольцевая форма ДНК, содержащая однонитевый разрыв составляла >90%, а при температуре 30° С, накопления в растворе такой ДНК не наблюдалось. Однако, проведение реакции гидролиза ДНК ColE I при температуре 30° С при более низкой концентрации субстрата, позволило выявить образование кольцевой формы ДНК и в этих условиях [327]. Таким образом было показано [266, 327], что расщепление ДНК ColE I рестриктазой EcoR I осуществляется при определенных условиях по несогласованному механизму, т. е. сначала происходит гидролиз одной цепи ДНК с •образованием промежуточной формы, содержащей однонитевый разрыв, а затем расщепляется вторая цепь. Однако в зависимости от температуры, расщепление второй цепи может происходить и в составе одного и того же фермент-субстратного комплекса.
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed