Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Было показано, что вариант гидролиза плазмидной ДНК рМВ9 эндонуклеазой рестрикции EcoR I зависит от начального состояния реакции: в том случае, когда реакция начиналась смешиванием раствора фермента с раствором ДНК, содержащим ионы Mg2+, реакция шла по пути образования свободной формы ДНК Н (содержащей однонитевый разрыв). Однако, в том случае, когда на первой стадии реакции происходило смешивание раствора фермента с ДНК с последующим добавлением ионов Mg2+, реализовался механизм гидролиза ДНК, приводящий к одновременному расщеплению обеих цепей ДНК в составе одного и того же фермент-субстратного комплекса.
Для объяснения этих фактов было выдвинуто предположение, что лимитирующей стадией гидролиза являются конформа-
ционные превращения рестриктазы, протекающие при связывании с ДНК. В первом случае, при образовании комплекса ДНК с рестриктазой EcoR I, происходят конформационные из. менения в одной субъединице фермента, в результате которых эта субъединица фермента активируется и осуществляется расщепление фосфодиэфирной связи в одной цепи ДНК. Однако, так как конформационные изменения протекают медленнее всех других стадий, фермент успевает диссоциировать с ДНК до активации следующей субъединицы. Во втором случае, когда на первой стадии реакции образуется комплекс фермента с ДНК и реакция начинается добавлением ионов Mg2+, проходит время, достаточное для активации в результате конформа-ционных изменений обеих субъединиц, что и приводит к реализации согласованного механизма расщепления субстрата при добавлении ионов Mg2+. На первый взгляд эта гипотеза опровергала предположение, что различия в механизме гидролиза ряда ДНК зависит от нуклеотидных последовательностей, окружающих участок узнавания. Это противоречие могло бы быть исключено в том случае, если фланкирующие нуклеотидные последовательности оказывают влияние, именно, на скорость конформационного перехода, приводящего к активации фермента в комплексе с ДНК, что позволило бы согласовать обе гипотезы. Гипотеза о конформационных изменениях в рестриктазе EcoR I, протекающих в комплексе с ДНК, еще ждет экспериментальной проверки.
Несмотря на то, что кинетика гидролиза кольцевых молекул ДНК другими эндонуклеазами рестрикции П-го типа, исследована в настоящее время для узкого круга рестриктаз, имеющиеся данные подтверждают общность механизма, предложенного для рестриктазы EcoR I и детально обсужденного выше. Так было показано [159], что при гидролизе плазмидных ДНК рестриктазами Sal I и BamH I, не наблюдается накопления промежуточного продукта в виде кольцевой ДНК, содержащей однонитевый разрыв и расщепление обейх цепей ДНК происходит, по-видимому, в составе одного и того же промежуточного фермент-субстратного комплекса. Однако, в случае гидролиза плазмиды рМВ9 рестриктазой ВашН I, при температуре 1°С, показано [355] накопление промежуточной формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Механизм гидролиза плазмидных ДНК, приводящий к накоплению промежуточного продукта в виде кольцевой ДНК был также установлен для Нра II [327] и Hha II [197].
6.1.3. Исследование процесса гидролиза линейных форм ДНК эндонуклеазами рестрикции
В предыдущем разделе, посвященном обсуждению механизмов гидролиза двухспиральной ДНК, речь в основном шла о
взаимодействии с кольцевыми формами ДНК. Использование этих субстратов имеет некоторые преимущества перед линейными. Во-первых исследование кинетики гидролиза таких ДНК молекул затруднено, так как в случае применения метода электрофореза необходимо использовать специальные приемы для идентификации однонитевого разрыва. Во-вторых, длинные линейные двухспиральные молекулы, например, ДНК фага X, содержат обычно несколько участков узнавания, которые как было показано в классической работе [371], расщепляются рестриктазой EcoR I с различной скоростью. Это затрудняет кинетический анализ. Более подробно этот вопрос был изучен [162] на делеционных вариантах ДНК фага содержащих уникальные участки узнавания рестриктазы EcoR I в различном окружении. Было установлено, что при низких ионных силах (порядка 50 мМ NaCl) не наблюдается различий в реакционной способности разных участков узнаваемых рестриктазой EcoR I, что определенным образом противоречило данным другой публикации [371]. Однако неодинаковая скорость расщепления различных участков узнавания в последнем случае была обнаружена при более высокой (порядка 150 мМ NaCl) ионной силе. Было выдвинуто предположение [162], что разница в скорости гидролиза различных участков узнавания имеет кинетическую природу, т. е. обусловлена неодинаковым взаимодействием нуклеотидных последовательностей, окружающих различные участки узнавания, с ферментом в переходном состоянии реакции. Это предположение было частично подтверждено тем, что, как было установлено [160], константы связывания EcoR I с различными участками ДНК были одинаковыми.
Исследование кинетики расщепления линейных молекул ДНК, содержащих уникальный сайт узнавания рестриктазы EcoR I, показало [186], что скорость реакции гидролиза зависит от длины ДНК. Так, скорость расщепления рестриктазой EcoR I ДНК длиной 1361 нп в 9 раз превышала скорость гидролиза фрагмента ДНК длиной 34 нп. Эти экспериментальные результаты позволили авторам [186] выдвинуть предположение, что процесс локализации специфической нуклеотидной последовательности, расположенной на линейной молекуле ДНК происходит не в результате случайных столкновений фермента с ДНК, а путем его одномерной диффузии вдоль молекулы ДНК, т. е. рестриктаза на первой стадии, по-видимому, связывается с неспецифической нуклеотидной последовательностью, а локализация специфической последовательности происходит в результате одномерной диффузии. Также показано [368], что после расщепления сайта узнавания рестриктазой EcoR I, фермент может передвигаться по ДНК в результате одномерной диффузии до следующего сайта, что может приводить к процессивному распределению узнаваемых участков, если они
