Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 38

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 107 >> Следующая

Дальнейшее детальное изучение [328] кинетики реакции гидролиза ряда кольцевых форм ДНК, таких как ДНК вируса SV 40, ДНК репликативной формы бактериофага G4 и ДНК ColE I, эндонуклеазой рестрикции EcoR I в условиях избытка субстрата при температуре 37° С, показало, что в случае ДНК фага G4 и ДНК ColE I не наблюдается накопления промежуточной формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. При гидролизе ДНК вируса SV 40 в этих же условиях в растворе накапливается около 25% ДНК в такой форме. В результате этих исследований [328] была предложена следующая общая кинетическая схема гидролиза двухцепочечной плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции EcoR I:
... *L rI— Е*Ш
Ml*-
Е*П
где I — суперспирализованная кольцевая форма ДНК;
II — кольцевая форма ДНК, содержащая однонитевый разрыв;
III — линейная форма ДНК-
Согласно предложенной схеме на первой стадии процесса происходит образование фермент-субстратного комплекса EI эндонуклеазы рестрикции EcoR I и двухцепочечной плазмидной ДНК. Ключевым моментом схемы является образование комплекса E-II эндонуклеазы рестрикции EcoR I с кольцевой формой ДНК, содержащей однонитевый разрыв, полученной в результате гидролиза фосфодиэфирной связи в одной из цепей ДНК- В дальнейшем в зависимости от условий (природы субстрата, температуры и т. д.) может происходить или расщепление второй цепи ДНК в составе того же комплекса Е - II с образованием комплекса Е-III-фермента с линейной формой ДНК или диссоциация комплекса E-II с образованием свободного фермента и кольцевой ДНК, содержащей однонитевый разрыв, что и приводит к накоплению формы II в растворе. Эта схема позволила объяснить различия в механизмах гидролиза ДНК вируса SV 40 с одной стороны и ДНК ColE I и бактериофага G4 с другой. В случае ДНК вируса SV 40 происходит диссоциация фермент-субстратного комплекса E-II, приводящая к накоплению кольцевой формы ДНК в растворе. Было высказано предположение, что различия в механизме гидролиза этих ДНК молекул (вируса SV 40; ДНК ColE I и бактериофага G4) являются результатом взаимодействия рестриктазы EcoR I с различными нуклеотидными последовательностями, фланкирующими участок узнавания рестриктазы EcoR I. Однако, такое предположение не позволяет объяснить различия в механизме гидролиза кольцевой ДНК ColE I в зависимости от температуры (см. выше).
Детальное изучение [34] влияния температуры на гидролиз ДНК ColE I рестрикционной эндонуклеазой EcoR I выявило довольно сложную зависимость механизма реакции от температуры. Так, в области температур 0—10° С, наблюдается накопление в растворе формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв, что подтверждает данные работы [266]. В области температур 25—37° С накопление кольцевой формы ДНК в растворе не наблюдается, так как расщепление обеих цепей ДНК происходит, по-видимому, в составе одного из того же фермент-суб-стратного комплекса, с образованием линейной формы ДНК. Однако, в области температур 40—55° С, наряду с образованием линейной формы ДНК, наблюдается накопление кольцевой формы ДНК-
Можно предположить что изменение механизма реакции в зависимости от температуры, связано с различным ее влиянием на отдельные кинетические константы элементарных стадий реакции гидролиза и смене лимитирующей стадии реакции гидро-
лиза при изменении температуры. Так, если предположить, что при низких температурах (0—10° С) k5>к3, то промежуточная форма ДНК, содержащая однонитевый разрыв (форма II), будет накапливаться в растворе. При повышении температуры (в области температур 25—37° С) из-за предполагаемой разницы в энергиях активации процессов может реализоваться обратное соотношение констант скоростей элементарных стадий, а именно, кз>к5. Это должно привести к тому, что не будет наблюдаться (накопления формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв в растворе.
Следуя логике вышеизложенных рассуждений аналогично можно объяснить и влияние фланкирующих участков узнавания последовательностей, что имеет место в случае ДНК SV 40, ColE I и G4. Это влияние может проявиться именно на «кинетических» стадиях реакции, приводя к изменению ее энергии активации, в результате дополнительных взаимодействий определенных нуклеотидных последовательностей с ферментом в переходном состоянии реакции и, тем самым, оказывать влияние на лимитирующую стадию процесса.
Дальнейшее развитие исследования по изучению механизма гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции получили в работах Халфорда с сотр. [159—162, 164, 245, 246].
В результате кинетических исследований процесса гидролиза плазмиды рМВ9, содержащей один участок узнавания рестриктазы EcoR I, было установлено, что происходит накопление в растворе формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Таким образом механизм реакции является аналогичным таковому, предложенному для гидролиза ДНК вируса SV 40 рестриктазой EcoR I [328].
Изучение этой реакции, в условиях избытка фермента относительно субстрата, при использовании непрерывного метода регистрации активности эндонуклеазы EcorR I методом флуоресценции [159] позволило выявить дополнительные детали в механизме гидролиза ДНК-
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed