Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Выбор способа подготовки зависит от объекта и его особенностей. Чаще всего используют маннит или сорбит, иногда в комбинации с ДМСО [4].
После подготовки перед добавлением криопротекторов клеточные суспензии концентрируют. Поскольку центрифугирование (даже в течение 5 мин при 100 g) повреждает многие растительные клетки, то применяют осаждение в цилиндре или прямо в колбе, которые устанавливают в сосуд со льдом. Длительность осаждения 15— 30 мин в зависимости от размера клеток и их агрегатов. Небольшие агрегаты с мелкими наиболее жизнеспособными и устойчивыми клетками оседают последними. После осаждения надосадочную жидкость отсасывают.
Наиболее эффективными криопротекторами являются глицерин, ДМСО, этиленгликоль и его производные, пролин, сахароза и глюкоза. Кроме того, появились сообщения о криозащитном действии и ряда других (помимо пролина) аминокислот и близких соединений (например, глицин-бетаин, гамма-аминомасляная кислота, оксипро-лин и аспартат). Все эти вещества используются как порознь, так и в комбинациях, что позволяет уменьшить их токсичность. Например, полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 6000 действует именно таким образом, поскольку сам не защищает [25]. Токсичность свежеочищенного ДМСО меньше, чем коммерческого, но способ очистки трудоемкий [26]. Чтобы снизить токсичность и осмотический стресс, обеспечив в то же время 5—15%-ные концентрации криопротекторов, заранее готовят раствор удвоенной по сравнению с конечной концентрацией, который содержит защитные вещества в желаемом-соотношении. Запасной раствор охлаждают и добавляют к охлажденному осадку клеток в соотношении 1 : 1 не сразу, а четырьмя порциями с интервалами по 15 мин, перемешивая. Затем клетки в этом растворе переносят в ампулы и держат на льду 30—60 мин для уравновешивания с раствором до переноса в камеру замораживания, температура в которой к этому времени должна быть снижена примерно до 0 °С. Поскольку чувствительность различных растительных клеток к химическому и плазмолизирующему действию очень разная, то необходимы предварительные испытания допустимых концентраций и времени действия криопротекторов. Может быть полезна дополнительная защита, которую на клетках моркови обеспечивала эмбриональная телячья сыворотка. Ею заменяли питательную среду и затем добавляли ДМСО [27].
Хотя для наиболее мелких и устойчивых клеток (например, моркови) допустимы скорости замораживания 1—4 °С/мин, но для существенно более крупных и вакуолизированных, к которым относится подавляющее большинство культивируемых in vitro клеток растений, рекомендуется скорость 0.5 °С/мин, а для самых больших агрегатов и апексов еще меньшие скорости [8]. Аппараты программного замораживания выпускает Специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины АН УССР в Харькове. Рекомендуемые скорости обеспечивает аппарат УОП-6. Предложенная нами достаточно универсальная программа замораживания, уже обеспечившая успех с 13 клеточными штаммами шести видов растений и меристемами трех видов, отличается применением «затравки», т. е. принудительной инициацией кристаллизации. Затравка должна быть при температуре на 1—2 °С (не более) ниже точки замерзания криозащитного раствора. Эта точка равняется сумме величин —Л/, характерных для каждого растворенного вещества и пропорциональных его концентрации. Для очень концентрированных растворов существуют отклонения от линейной зависимости. Для затравки мы на самое краткое время открываем камеру программного замораживателя и погружаем в жидкий азот (на 0.5—
1.0 с) либо перфорированную кассету с ампулами, либо только дно
нескольких ампул, закрепленных в штативе. В последнем случае, если объектов в ампуле мало (меристемы), то помещаем их в пакетике наверху раствора. Способ затравки был затем усовершенствован и предложено дополнительное устройство для его осуществления, которое позволяет не открывать камеру [28, 29].
После затравки целесообразно стабилизировать температуру на том же уровне до кристаллизации всего раствора в ампуле. Для этого достаточно 20 мин [8]. Далее мы снижаем температуру с той же заданной скоростью до —30 °С, а затем со скоростью около 9 °С/мин до —70 °С и быстро переносим ампулы в жидкий азот. Именно при этой конечной температуре медленного замораживания получали, по-видимому, максимальную выживаемость клеток наперстянки [17]. Но по данным ядерно-магнитного резонанса минимум жидкой воды, являющийся критическим для выживания клеток барвинка, в среде с 1 М сорбита и 5 % ДМСО достигается уже при —40 °С, а при —30 °С эта величина была лишь немного выше [30]. В клетках диоскореи льда не было вплоть до —27 °С (конечная температура) при условии замораживания с затравкой со скоростью 0.7—1.0°С/мин в присутствии 7%-ного ДМСО. Иными словами, свободная вода, способная замерзнуть, успевала выйти из клеток и около —30 °С ее уже почти не оставалось, так как ниже этой температуры в других опытах было возможно резко увеличить скорость замораживания с хорошими результатами [31]. Следовательно, конечная температура может быть —40 °С. Если же для большей уверенности в успехе снижать ее еще больше, то можно (и, вероятно, лучше, поскольку длительней сильный плазмолиз губителен) увеличить скорость замораживания.
