Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Перевиваемые клеточные культуры можно замораживать и со скоростью 1—2 °С/мин до —80 °С с последующим погружением в жидкий азот, для этого пригодно большинство программных замораживателей. В случае невозможности реализации этой программы на имеющемся замораживателе либо при его отсутствии ’ ампулы помещают в пенопластовую коробку с толщиной стенок около
2.0 см и ставят в низкотемпературный холодильник с температурой —80 °С на 2 ч; после чего: ампулы переносят в жидкий азот. При температуре —196 °С клетки перевиваемых культур можно хранить в течение нескольких лет без существенных» изменений их морфофункциональных свойств.
Отогрев замороженных образцов лучше производить в специально сконструированных водяных банях, снабженных нагревательным элементом, регулятором температуры и устройством для покачивания ампул. При помощи длинного пинцета1 ампулы переносят из жидкого азота в водяную баню с температурой 41 °С. Ампулы объемом 1 мл при таком режиме размораживаются в течение 0.5—1.0 мин, что зависит от материала, из которого изготовлены ампулы. При размораживании ампул следует соблюдать некоторые предосторожности: использовать плексигласовый щиток и защитные перчатки, так как при нарушении герметичности ампулы могут взрываться.
После размораживания ампулы вскрывают и переносят их содержимое в центрифужные пробирки, в которые вносят ростовую среду, разбавляя суспензию клеток в 5—10 раз, среду вносят медленно, по каплям, постоянно перемешивая, длительность этого процесса 5—7 мин. Суспензию клеток выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин, затем пробирки центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляют, а к осадку клеток добавляют порцию свежей или кондиционированной среды, ресуспензируют, суспензию клеток доводят до посевной концентрации и высевают в культуральные флаконы.
Для восстановления клеток после хранения в жидком азоте лучше использовать кондиционированную среду, которую собирают с культуры клеток на 3—4-е сутки после посева клеток, фильтруют через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0.22—0.45 мкм и хранят при температуре —20 °С. При восстановлении клеток можно использовать кондиционированную среду от любой клеточной линии, культивируемой на той же среде, что и восстанавливаемые клетки.
После размораживания определяют концентрацию сохранившихся клеток, для чего в суспензию добавляют равный объем 0.2%-ного трипанового синего, окрашивающего мертвые клетки в синий цвет. Окрашенную суспензию заправляют в счетную камеру Горяева.
О жизнеспособности клеток можно судить по способности образовывать колонии, по скорости пролиферации, по интенсивности синтеза ДНК.
Одним из критериев степени сохранности клеток после криоконсервирования может служить показатель интенсивности поглощения кислорода в присутствии 0.01 М сукцината [29]. Если добавление к размороженной суспензии не вызывает стимуляции дыхания в клетках, то это является свидетельством сохранения целостности клеточных мембран, вследствие чего сукцинат не проникает в клетки.
Предлагаемый метод криоконсервирования по 2-этапной программе со скоростью 30—40°С/мин под защитой 10%-ного ДМСО позволяет сохранять основные функциональные свойства клеток, что дает возможность использовать их после криоконсервирования в различных областях биологии, медицины и вирусологии. Однако следует учесть, что клетки перевиваемых культур после криоконсер-вированйя изменяют чувствительность к вирусам. Это связано с временным ингибированием синтеза интерферона, в результате чего репродукция вируса в замороженной культуре выше, чем в нативной. Повышенная чувствительность клеток к вирусам проявляется на протяжении первых двух пассажей после криоконсервирования, впоследствии чувствительность клеток к вирусам возвращается к исходному значению.
Литература
1. Залюбовская Н. П., Киселева Р. И. Консервирование клеток культур тканей методом глубокого замораживания // Вопр. вирусологии. 197.5. № 6. С. 734—738.
2. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1973. 331 с.
3. Юдина Н. С. Криоконсервирование и сохранение клеточных культур в лабораторных и производственных условиях: Автореф. дис. . . . канд. биол. наук. Покров, 1974. 19 с.
4. Coriell L., Greene А. Е., Silver R. К. Historical development of cell and tissue culture freezing //Cryobiology. 1964. Vol. 1. P. 72—79.
5. Дьяконов Л. П., Поздняков А. А., Панков Г. E. и др. Методические указания по криоконсервированию культур клеток животного происхождения в жидком азоте. М., 1978. 9 с.
6. Красиков Г. А., Наумец 3. П. А. с. № 549471 (СССР). Способ замораживания клеточных культур //Опубл. Открытия. Изобретения. 1977. № 9.
7. Шонов И. П., Соса Н. Н. А. с. № 23816 (НРБ). Способ глубокого замораживания клеток ВНК и клеток почки теленка // Опубл. РЖБ. 1982. № 7. 04 А. С. 30.
8. Kendall О. S. Low-temperature storage of surface-attached living cell culture// Cryobiology. 1981. Vol. 18. P. 251—257.
9. Mazur P., Schmidt J. J. Interactions of cooling velocity, temperature and warming velocity on the survival of frozen and thawed yeast //Cryobiology. 1968. Vol. 5. P. 1 — 17.
