Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
факторы ФРФ 1 --- 10 »
НРФ 1 --- 10 »
Простаглан- F 2а 1 ---100 нг/мл
дины Е, 1 --- 100 »
Транспортные Трансферрин 0.5---100 мкг/мл
белки Альбумин 0.5---2 мг/мл
Факторы при Фибронектин 0.5---5 мкг/мл
крепления Сывороточный фактор 0.5---5 »
распластывания
Фетуин 1 мг/мл
‘Примечание. Альбумин добавляется с линолевой кислотой (3—5 мкг/мл).
нимых компонентов восполняет DME. В среду вводят 0.015 М HEPES (pH 7.2) с соответствующим уменьшением концентрации бикарбоната (1.2 г/л).
Наиболее универсальными добавками к базовой среде являются пептидный гормон инсулин и сывороточный белок, переносящий железо, — трансферрин. Стимулируют размножение клеток многих типов стероидный гормон гидрокортизон и его синтетический аналог дексаметазон, гормон, вырабатываемый щитовидной железой, — трийодтиронин, а также ростовые факторы, особенно эпидермальный. Необходимую клеткам линолевую кислоту обычно вводят в среду в комплексе с сывороточным альбумином, предварительно очищенным от связанных с ним жирных кислот. Прикрепления клеток к субстрату добиваются либо добавляя к среде фибронёктин или сывороточный фактор распластывания, либо покрывая поверхность субстрата полилизином или коллагеном. При культивировании клеток без сыворотки часто выявлялась их потребность в питательных веществах, отсутствующих или недостающих в базовой среде.
Недавним примером [26] удачного использования стандартной среды для бессывороточного культивирования нормальных клеток является размножение кератиноцитов мыши в бескальциевой среде Игла с заменимыми аминокислотами, в которую добавлены инсулин
(5 мкг/мл), ЭФР (5 нг/мл), трансферрин (5 мкг/мл), гидрокортизон (5 • 10~7М), этаноламин и фосфоэтаколамин (по 5 • Ю М) и экстракт из гипофиза (180 мкг белка на 1 мл). Однако бессыворо-точное культивирование в стандартных средах удается обычно лишь в случае опухолевых клеток и постоянных клеточных линий.
Наиболее последовательный путь создания питательной среды определенного состава для ранее не культивировавшихся клеток состоит по крайней мере из трех этапов [27]. Во-первых, для проведения испытания компонентов культуральной системы необходимо найти условия, при которых клетки размножаются достаточно хорошо. Для этого используются любые среды неопределенного состава, включающие сыворотки или тканевые экстракты, кондиционированные среды, а также культивирование в присутствии облученных клеток-фидеров. На следующем этапе, вводя в среду необходимые клеткам низкомолекулярные вещества в концентрации, оптимальной для размножения, шаг за шагом понижают концентрацию компонентов неопределенного состава. Конечным этапом является замена оставшегося небольшого количества сыворотки и ей подобных компонентов соответствующей смесью известных веществ по Сато. Оптимизация базовой среды позволяет уменьшить ассортимент и концентрацию добавляемых факторов.
Методические рекомендации
Обзор питательных сред целесообразно закончить описанием их приготовления. Поскольку процедура стерилизации сред фильтрованием, а также методика приготовления некоторых стандартных сред, используемых в основном для выращивания фибробластов и им подобных клеток, описаны в отечественной литературе [8—10], здесь предлагается пропись среды, оптимизированной для нормальных кератиноцитов из кожи человека (MCDB-153). Близкие по составу среды применяются при культивировании различных эпителиальных клеток.
Общие рекомендации. Питательные среды и все растворы, соприкасающиеся с клетками, следует готовить на свежей сверхчистой воде, полученной на специальных установках. Допустимо использование деионизованной воды, перегнанной затем трижды в стеклянных дистилляторах. Повышенные требования предъявляются также к чистоте используемых реактивов.
Растворы, содержащие компоненты сред и хранящиеся незамороженными, должны быть стерилизованы.
Среда MCDB-153 [28, 29]. Сначала последовательно приготавливают концентраты (табл. 4). Концентрат 1 готовят, растворяя аминокислоты по очереди в теплой воде. В процессе приготовления концентрата 3 следует иметь в виду, что в нейтральном и слабокислом растворах фолиевая кислота образует едва различимую взвесь, которая при стерилизации задерживается на фильтре. Двуза-мещенный фосфат натрия создает щелочные условия, необходимые
Н ! <¦
Таблица 4
Состав концентратов для приготовления среды MCDB-153 [28, 29]
К!
№, кратность н условия хранения концентрата
1 (X 100), 4 °С — 2 мес, —20 °С — дольше
2 (X 100), 4 °С — 2 мес, —20 °С — дольше
3 (Х50), 4 °С — 2 мес, —20 °С — дольше
4а (ХЮ00), 18—22 °С
46 (ХЮ00), 18—22 °С
4в (Х200), 18—22 °С
5 (Х1000), 18—22 °С
