Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
(по степени и длительности) плазмолиз и последующая полная потеря осмотической реактивности в результате нарушения целостности плазмалеммы непосредственно в сжатом состоянии [10]. Наиболее полная сводка данных по вопросам криоповреждений, криозащиты и криоконсервации клеток растений имеется в недавно вышедшей книге под редакцией К. Карта [11].
Криоконсервация культур клеток и меристем растений в отличие от клеток животных во многих случаях начинается с этапа специальной подготовки, хотя и существуют культуры, для которых он не обязателен, и их достаточно просто поддерживать в очень хорошем состоянии. Но и такие культуры следует брать для глубокого замораживания в начале или в середине экспоненциальной фазы роста, когда они обогащены меристемоидными клетками в результате интенсивных делений. Отсюда простейший способ подготовки заключается в частых пересадках культуры, что позволяет поддерживать ее почти постоянно в ранней экспоненциальной фазе. Преимущество частых пересадок известно [12], иногда их приходится делать каждые 2— 4 сут [4, 13, 14]. Еще большее обогащение меристемоидными клетками достигается при синхронизации культур по митозам, что обеспечивается голоданием, охлаждением или действием ингибиторов [15]. К сожалению, возможности такой синхронизации клеток растений ограничены по сравнению с селективным сбором делящихся клеток животных, а специальные агенты могут вызывать мутации.
Остальные способы требуют предварительного культивирования в определенных условиях. При одном из способов в среду добавляли маннит или сорбит в концентрации 2—6 % на период от нескольких суток до 2—3 пассажей. Такой способ уменьшал размер клеток и, что еще важнее, их вакуолей, значительно улучшал выживание клеток явора, моркови, перца [16], обеспечивал криосохранение многих штаммов, в том числе и клеток наперстянки шерстистой [ 17]. Иногда концентрацию сорбита постепенно повышают до 1 М (18.2 %), но на срок не более суток [4, 14].
При втором способе предкультивирования используют аминокислоты и среди них в первую очередь пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно. Его концентрации постепенно поднимали для ряда клеток до 1 М (11.5 %) на срок до 4 сут [18, 19]. Но клетки других видов были очень чувствительны к пролину даже при кратковременной (1—2 ч) инкубации. Поэтому для клеток диоскореи мы использовали низкие концентрации (0.01 — 0.05 М) и не только пролина, но и аланина, серина и аспарагина в течение 4—6 сут. Больший срок предкультивирования приводил к дегенеративным изменениям в клетках. Наилучшие результаты были получены с аспарагином, остальные испытанные аминокислоты были менее эффективны [20]. Показано, что вместо пролина или вместе с ним у ряда видов растений значительную роль в осморегуляции играют аспарагин или глицин-бетаин. Кроме названных веществ для предварительного культивирования и криозащиты использовали также и гамма-аминомасляную кислоту [18].
Третий способ предварительного культивирования применяли
вначале только для апексов побегов — плотных организованных структур без межклетников, являющихся в сущности микроорганами размером около 500 мкм. Проникновение во внутренние клетки апексов даже легкопроникающего ДМСО и их дегидратация затруднены. ДМСО добавляли к среде, на которой шло предкультивирование в обычных для данных апексов условиях, в концентрации от 2.5 до 10% (чаще 5 % на срок до 48 ч [21, 22]). Для такого культивирования удобно использовать жидкую питательную среду и мостики из фильтровальной бумаги. Коммерческий ДМСО считается 100%-ным и является практически стерильным вследствие своей токсичности; растворы его можно автоклавировать. Иногда предкультивирование с ДМСО (5%-ным, до 24 ч) проводится и с некоторыми клеточными штаммами в суспензионных культурах, но это возможно только с очень устойчивыми клетками [4].
Четвертый способ предварительного культивирования осуществляется в условиях искусственного закаливания к холоду, он применим к зимующим растениям умеренного климата. Для клеточных, тканевых и органных культур незимующих растений он непригоден. В случае культур меристем целесообразно предварительно закаливать сами растения, из которых затем стерильно вырезают меристемы и культивируют их на среде с ДМСО. Суть закаливания сводится к имитации естественного осеннего процесса подготовки растений к периоду зимнего покоя. У разных групп растений конкретные цитофизиологические механизмы такой подготовки различны. При работе с клеточными суспензионными или каллусными культурами обычно цх (так же как и растения) или сразу помещают в условия с температурой от 2 до 5 °С на срок от 1 до 6 нед, или сначала в течение нескольких суток выдерживают при температуре 8—10 °С. Остальные условия культивирования сохраняют прежними. Более эффективно закаливание в присутствии сахарозы. Для каллусных культур ее добавляют до 12—15% [1, 23]. Для суспензионных культур женьшеня мы получили наилучшие результаты, если после выращивания в обычных условиях в течение недели (примерно до конца экспоненциальной фазы роста) переносили их в условия с температурой 10 °С на 5—7 сут, добавляя сахарозу до 7 %, а затем выдерживали 2 нед при 2 °С, увеличивая концентрацию сахарозы сначала до 15, а через неделю до 20 % [24].
