Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 36

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 171 >> Следующая

Кинетика проникновения криопротекторов внутрь клетки зависит от свойств мембран биологических объектов, состава среды и температуры эквилибрации [13]. Установлено, что для получения криоза-щитного эффекта в присутствии 5—10 % глицерина, ДМСО, ПВП или ПЭО подготовка клеток к приоконсервированию завершается в течение 5—12 мин при температуре 22—37 °С [21]. При более длительной эквилибрации в клетках появлялись морфологические изменения, которые были обратимы, если время контакта с криопротектором не превышало 2 ч [17].
Основой любой среды консервирования является ростовая среда. Однако модифицируя ее состав путем увеличения содержания сыворотки и добавления различных веществ, можно повысить эффективность разработанного метода криоконсервирования. Хорошие результаты получены при использовании в качестве основы кондиционированной среды [18,22].
Успех криоконсервирования во многом зависит от исходного морфофункционального состояния клеток: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературного консервирования, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста.
Немаловажную роль играет плотность замораживаемой клеточной суспензии [12, 20, 23]. Оптимальные результаты восстановления
были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1 • 106—5 • 106 клеток в 1 мл [4, 12].
Жизнеспособность клеток в суспензии зависит от скорости отогрева. Установлено, что при ее увеличении количество выживших клеток в суспензии возрастает [13, 24]. В настоящее время существует несколько методов размораживания биологических объектов — в водяной бане, в сверхвысокочастотном электромагнитном поле, с использованием высокого давления. Размораживание в водяной бане при температуре 40—41 °С является наиболее доступным и распространенным.
После криоконсервирования и хранения в жидком азоте клетки перевиваемых культур особенно нуждаются в оптимальных условиях культивирования, так как восстановление нелетальных повреждений, возникающих при замораживании—оттаивании, возможно только при благоприятных условиях. Установлено, что процессам восстановления способствует инкубирование клеток в среде, содержащей уабаин, или в среде с пониженным содержанием кислорода; а также в кондиционированной среде [25—27]. Стимулирующее действие на пролиферацию клеток перевиваемых культур после криоконсервирования оказывает инсулин [14].
Исследования особенностей восстановительных процессов в клетках перевиваемых культур после криоконсервирования в зависимости от условий культивирования показали, что в кондиционированной среде все процессы протекали значительно быстрее, чем в свежей ростовой среде. Об этом свидетельствовали стимуляция процессов синтеза «ДНК в клетках и увеличение скорости адгезии при инкубировании клеток в кондиционированной среде. Восстановительными свойствами обладала кондиционированная среда от клеток разных линий.
На основании литературных данных и проведенных исследований был разработан метод криоконсервирования клеток перевиваемых культур [28]. Для криоконсервирования отбирают клетки в экспоненциальной фазе роста. Культуры, растущие в монослое, снимают с поверхности матраса по общепринятой методике. Клетки ресуспен-зируют в небольшом количестве кондиционированной среды, доводя концентрацию до 1 • 107—2 • 106 клеток в 1 мл. Нужную концентрацию клеток, растущих в суспензиях, получают путем центрифугирования и удаления части ростовой среды. Подготовленная к криоконсервированию суспензия клеток не должна содержать конгломераты.
Рабочий раствор криопротектора ДМСО (20%) готовят непосредственно перед замораживанием на свежей или на кондиционированной ростовой среде. К полученной суспензии клеток добавляют равный объем 20 %-ного раствора криопротектора дробными порциями, по каплям, постоянно перемешивая суспензию клеток, доводя’ содержание криопротектора до конечной концентрации 10 % в течение 5—7 мин. Подготовленную таким образом суспензию переносят в ампулы и тщательно закупоривают. Оптимальное время эквилибрации клеток с криопротектором при комнатной температуре не
должно превышать 15 мин. В случае невозможности соблюдения указанного времени ампулы следует поместить в холодильник при температуре 4 °С, в данных условиях ампулы с суспензией клеток можно выдерживать в течение 1 ч.
Для большинства перевиваемых клеточных линий оптимальные результаты получены при охлаждении по 2-этапной программе:
1) от 20 до —28 °С со скоростью 30—40 °С/мин, затем 15-минутная остановка при —28 °С; 2) от —28 °С до —196 °С со скоростью 300—400 °С/мин.
При отсутствии замораживателя эту программу можно осуществить, используя спиртовую баню, хотя это и менее эффективно, для чего 0.5—1.0 л спирта помещают в термос с металлической внутренней колбой и путем медленного добавления жидкого азота при постоянном перемешивании доводят температуру спирта до —30—
32 °С. После чего ампулы погружают в спирт на 15 мин, контролируя при этом его температуру (она не должна быть выше —28 °С и ниже —32 °С), затем ампулы переносят в жидкий азот.
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed