Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
6а (Х100), —20 °С
66 (X 100), —20 °С
6в (ХЮ0), — 20 °С
7 (ХЮ0), — 20 °С
8 (X 100), 4 °С —2 мес, —20 °С — дольше
9 (X 100), 4 °С —2 мес, —20 °С — дольше
10 (X 100), 4 °С — 2 мес, —20 °С — дольше
11 (мг/л, X 100), 18—22 °С
Компонент
Аргинин- НС1
Гистидии- НС1- НгО
Изолейцин
Лейцин
Лизии- НС1
Метионии
Фенилаланин
Треонин
Триптофан
Тирозин
Валин
Холин
Серии
Биотин
Пантотенат Са Ниацинамид Пиридоксин- НС1 Тиамин- НС1 КС1
Фолиевая кислота Na2HP04- 7Н20
СаС12- 2Н20 MgCI2- 6Н20 FeS04- 7Н20 Феноловый красный Глютамин Пируват Na Рибофлавин Цистеин- НС1- Н20 Аспарагин Пролин Путрисции Витамин В|2 Аланин
Аспарагиновая кислота
Глютаминовая кислота
Глицин
Аденин
Инозит
Липоевая кислота Тимидии CuS04- 5Н20 CuS04- 5Н20 MnS04- 4Н20 (NH4)6Mo,024- 4Н20 NiCl2- 6Н20 H2Se03
Na2Si03- 5Н20 SnCl2- 2Н20
nh4vo3
ZnS04- 7Н20
Концентрация, г/л
21.07
1.677
0.1968
6.56
1.827
0.4476
0.4956
1.191
0.306
0.2718
3.513
1.396
6.306
0.00146
0.0258
0.003663
0.006171
0.03373
11.183
0.0395
26.81
4.411 >.
122.0
0.278
1.242
14.62
5.50
0.003764
4.204
1.501
3.453
0.01611
0.0407
0.891
0.399
1.471
0.751
2.432
1.802
0.02063
0.07266
0.000249
0.0249
0.0223
0.1236
0.01188
0.3869
10.61
0.01128
0.05849
14.38
,.ч
X
о •
II
4}
н
о
п
)
для полного растворения фолиевой кислоты. Будучи растворена, она остается в растворе даже при небольшом подкислении.
Концентрат 4в готовят, растворяя соль в 2.5 мл 4 н. HCI, а затем разбавляя водой до 1 л (при образовании оранжевого осадка не пригоден). Концентрат 6в (рибофлавин) необходимо защищать от света. Концентрат 7 следует закрывать особенно плотно, чтобы предотвратить окисление цистеина кислородом воздуха (при появлении осадка не пригоден). Для приготовления концентрата 9 к воде, объем которой немного меньше конечного, добавляют при постоянном перемешивании 1 мл раствора фенолового красного (концентрат 5) на 1 л, а затем аспарагиновую и глютаминовую кислоты. Их растворения добиваются, поддерживая нейтральность раствора с помощью 1 н. NaOH. После того как взвесь исчезнет и раствор приобретет устойчивую оранжевую окраску, в нем растворяют аланин и глицин, а затем доливают воду до конечного объема. Концентрат 10 тоже готовят в несколько этапов. Сначала растворяют аденин в 0.6 мл 4 н. NaOH с подогревом до 40 °С, затем раствор разбавляют водой. Отдельно растворяют липоевую кислоту в нескольких каплях 1 н. NaOH и раствор разбавляют водой. В смеси этих растворов легко растворяются остальные компоненты.
Для приготовления 1 л среды к 800 мл воды добавляют с перемешиванием следующие концентраты: 1 и 2 (по 10 мл), 3 (20 мл), 5 (1 мл), 6а (60 мл), 66, 6в, 7, 8, 9 и 10 (по 10 мл). В этой смеси растворяют глюкозу (1.081 г), NaCl (7.599 г), СНзСОО№ (0.5 г), HEPES (6.6 г) и подводят pH к 7.4 с помощью 4 н. NaOH. Затем добавляют NaHC03 (1.176 г) и воду до 983 мл. Полученную заготовку среды можно хранить замороженной при —20 °С до 6 мес. Полную среду готовят в малых количествах непосредственно перед использованием. Для этого к 98.3 мл заготовки добавляют концентраты 4а (0.1 мл), 46 (0.1 мл),4в (0.5 мл) и 11 (1 мл) и стерилизуют фильтрованием сразу же, чтобы предотвратить потерю на фильтре выпадающего в осадок железа. Можно также стерилизовать среду без концентрата 4в, а его, простерилизовав фильтрованием или авто-клавированием, добавить затем стерильно.
Дополнительные компоненты к среде MCDB-153 (1000-кратные концентраты). Сначала готовят буфер А состава: 0.03 М HEPES (7.149 г), 0.01 М глюкоза (1.802 г), 3» 10~3 М КС 1 (0.224 г), 0.13 М NaCl (7.697 г), 1 - 10“3 М Na2HP04 • 7Н20 (0.268 г), 3.3» 10_6 М феноловый красный (1 мл концентрата 5). Доводят pH раствора до 7.4 с помощью 4 н. NaOH и объем водой до 1 л. Буфер А стерилизуют фильтрованием и хранят при 4 °С.
Концентрат ЭРФ готовят (растворяя стерильный лиофилизиро-ванный ЭРФ) в стерильном буфере А в концентрации 5 мкг/мл (для опытов по клонированию) или 10 мкг/мл (для массового культивирования). Концентрат инсулина (5 мг/мл) готовят, растворяя его в 0.012 М HCI, и стерилизуют фильтрованием. При нейтральном pH инсулин выпадает в осадок из раствора такой концентрации. Концентрат гидрокортизона (0.5 мг/мл) готовят, растворяя его в абсолютном этаноле, и стерилизуют фильтрованием. Концентраты этанол-
Дополнительные компоненты к среде MCDB-153 дли; культивирования, криокоисервации и клонирования кератиноцитов человека
Компонент Культивиро Криоконсер- Клонирова
вание вацня ние
ЭРФ, нг/мл 10 10 5
Инсулин, мкг/мл 5 0 5
Гидрокортизон, 1.4 (0.5) 1.4 (0.5) 1.4 (0.5)
