Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
А. А. Цуцаева, Т. Ф. Петренко
Институт проблем криобиологии
и криомедицины АН УССР, Харьков
Важной задачей для работающих с клеточными культурами является длительное хранение клеток в функционально полноценном состоянии. На сегодняшний день единственным методом, обеспечивающим долгосрочное хранение клеточных линий, является криоконсервирование и хранение клеточных суспензий в жидком азоте. Благодаря интенсивным исследованиям использование низких температур для криоконсервации клеточных культур получило широкое распространение [1—4]. Методы криоконсервирования имеют различные модификации [5—8].
Успех низкотемпературного консервирования зависит от целого ряда факторов: вида и типа клеток, нх концентрации в суспензии, состава среды консервирования, вида и концентрации криопротек-гора, режима охлаждения и отогрева, способа реабилитации клеток
после отогрева [9—12]. Морфофункциональные особенности клеток определяют их устойчивость к воздействию факторов низкотемпературного консервирования, что обусловливает необходимость разработки оптимальных способов криоконсервирования для конкретных линий клеток.
Применяемые программы охлаждения весьма разнообразны. Для них характерны медленные скорости охлаждения, реализуемые либо на всех этапах охлаждения, либо до определенных температур с последующим погружением в азот. Оптимальным для целого ряда клеток оказался 2-ступенчатый режим с температурной остановкой [13—15]. Экспериментальные данные показали, что замораживание клеток перевиваемых культур без криопротектора по 2-этапной программе со скоростью 30—40 °С/мин с температурной остановкой обеспечивало в 2 раза большую сохранность, чем замораживание со скоростью 1—2 °С/мин. Так, при замораживании клеток Sp 2/0 по 2-этапной программе сохранялось 45—50 % клеток, а при медленном замораживании — 20—25 %.
Применение криопротекторов позволяет снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. Используют различные криопротекторы: сахарозу, декстран, этилен-гликоль, поливинилпирролидон (ПВП), диметилсульфоксид (ДМСО), полиэтиленоксиды (ПЭО) и др. [16]. По многочисленным данным,криопротекторы оказывают токсическое действие на биологические объекты, степень которого зависит от типа криопротектора, концентрации, степени очистки и времени контакта с клетками [12, 16—18, 19]. Для определения токсического действия криопротектора клеФки выдерживают при комнатной температуре с различными его концентрациями в течение 30—60 мин, после чего определяют их жизнеспособность. Степень защитного действия криопротекторов определяют также опытным путем, для чего суспензию клеток замораживают в среде, содержащей исследуемые криопротекторы в концентрации, не оказывающей токсического действия. После размораживания определяют жизнеспособность клеток. Вид криопротектора, концентрацию его в среде и состав криоконсерванта следует подбирать индивидуально для каждого типа клеток. От свойств криопротектора зависит и выбор режима охлаждения.
Глицерин и диметилсульфоксид—криозащитные агенты, получившие наиболее широкое применение для криоконсервирования клеток перевиваемых культур. Сравнительные данные по защитному действию этих криопротекторов весьма противоречивы [20].
Проведенные исследования по эффективности криозащитного действия этих веществ показали, что ДМСО обеспечивает не только более высокую жизнеспособность клеток, но также и сохранение их морфофункциональных свойств. Так, одним из показателей повреждения клеток является образование на мембране клеток выпячиваний (везикул). Количество клеток с такими морфологическими изменениями и характер этих изменений зависят от применяемого криопротектора. В суспензии клеток, замороженных в среде с 10 % глицерина, количество клеток с везикулами составляло около 12 %, в то
время как при замораживании в среде с 10 % ДМСО— только 1.5 %. Нарушения адгезивных свойств клеток после криоконсервирования были выражены в большей степени в случае применения в качестве криопротектора глицерина: при замораживании клеток в присутствии 10 % глицерина около 10 % клеток утрачивало способность к прикреплению и распластыванию; при использовании 10 % ДМСО — только 3%. Скорость адгезии также была ниже при использовании в качестве криопротектора глицерина.
Процесс криоконсервирования вызывает нарушения процессов эндогенного дыхания в клетках перевиваемых культур. Степень этих нарушений зависит от применяемого криопротектора. При использовании в качестве криопротектора 10 % глицерина уровень эндогенного дыхания снижался в 2—2.5 раза по сравнению с уровнем потребления кислорода нативными клетками, а при использовании 10 %• ДМСО—в 1.2—1.5 раза.
Анологичная зависимость от применяемого криопротектора отмечена и при определении интенсивности синтеза белков и ДНК, в клетках перевиваемых культур после криоконсервирования: ингибирование биосинтеза больше при криоконсервировании с 10 % глицерина.
При использовании того или иного криопротектора следует учитывать особенности взаимодействия его с молекулами воды. Так, часто при использовании ДМСО не учитывается экзотермический характер процесса гидратирования ДМСО, что может отрицательно повлиять на функциональную активность клеток b случае быстрого добавления этого криопротектора к суспензии клеток. Оптимальные результаты получены при постепенном увеличении концентрации ДМСО в среде замораживания от 0.01 до 10 % в течение 5—7 мин.
