Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
частота колебаний атомов уменьшается, т. е. поглощается свет большей длины волны. Для любой связи частота колебаний на изгиб (деформационных) меньше частоты колебаний растяжения связей.
164 Часть III. Аналитические методы
5.4.2. Оборудование
Однолучевые приборы обладают’рядом недостатков, ограничивающих их применение, и все промышленные инфракрасные спектрофотометры, использующиеся для аналитических целей, двухлучевые. В таких приборах все побочные эффекты, обусловленные растворителем и примесями, автоматически компенсируются, а также снимаются трудности, связанные с сильным поглощением двуокиси углерода и паров воды воздуха.
Источник света. Идеальным тепловым источником является, конечно, черное тело, но интенсивность его излучения очень мала, поэтому используют лампы накаливания. У них максимум в спектре испускания приходится на 2 мкм, и с увеличением длины волны интенсивность излучения сильно падает (при 15 мкм она составляет около 15% от максимальной). Лампы Нернста и Глобара имеют ряд недостатков, поэтому обычно используются источники с ни-хромовой нитью (рис. 5.2).
Монохроматоры. Первоначально в инфракрасных спектрофотометрах применяли призмы из бромистого калия или хлористого натрия, поскольку стекло для инфракрасного излучения непрозрачно (см. рис. 5.2), однако сейчас в качестве монохроматоров используют в основном дифракционные решетки. Это объясняется не только лучшим разрешением и линейной зависимостью дисперсии от длины волны, но и большей экономичностью решеток. Обычно для устранения интерферирующих лучей, идущих с дифракционной решетки, используют малодисперсные призмы или несколько интерференционных фильтров. Иногда вместо дорогих и непрочных линз из хлористого натрия применяют зеркала из полированного алюминия. Оптическая часть делается по возможности простой, поскольку при каждом отражении теряется 20% света.
Образцы. Образцы нельзя приготавливать в воде, поскольку она, как и органические растворители, очень сильно поглощает в инфракрасной области. Вода растворяет также почти все вещества, прозрачные в этой области спектра. Для уменьшения довольно большого фона, возникающего из-за рассеяния при снятии спектров поглощения в твердых порошках, приготавливают тонко размолотую пасту вещества в парафине или спрессованные диски в бромиде калия. В последнее время нашел применение другой способ снятия спектров, при котором уменьшают общее отражение. Он основан на законах отражения света на поверхности раздела между веществами с сильно различающимися коэффициентами преломления. Этот способ в последние годы значительно расширил область применения инфракрасной спектрофотометрии. Образец следует экранировать от источника света, чтобы его температура не увеличивалась больше, чем на 5°С в 1 ч.
Детекторы. В качестве детектора инфракрасного излучения
Гл. б. Спектроскопические методы 165
используют, как правило, батарею термопар, смонтированную в откачанном баллоне с прозрачным к инфракрасному свету окном. Иногда используется более дорогой и хрупкий элемент Голея. Он представляет собой чувствительный к давлению прибор, который состоит из запаянного резервуара с газом, расширяющимся при нагревании его инфракрасным излучением (см. рис. 5.2).
Ширина щели в спектрофотометрах меняется автоматически, чтобы при сканировании на детектор от кюветы сравнения попадало постоянное количество света.
Самописцы. Обычно самописцы являются составной частью прибора, и движение ленты согласовано, с изменением длины волны падающего света. Поскольку выходной сигнал инфракрасных детекторов зависит от энергии нелинейно, в системе регистрации используется сервомотор.
5.4.3. Применение инфракрасной спектрофотометрии в биологии
Несмотря на попытки использовать инфракрасную спектрофото-метрию для изучения биологических макромолекул и мембран, основное применение этого метода в биохимии — исследование структуры биологических молекул среднего размера. Он обычно используется в сочетании с ядерным магнитным резонансом и масс-спектрометрией.
5.5. Спектроскопия комбинационного рассеяния (рамановская спектрофотометрия)
Когда видимый монохроматический свет проходит через прозрачную среду, часть его выходит не поглотившись, часть поглощается, а 10-8 падающего света рассеивается под прямым углом к падающему пучку. Менее 1% рассеянного света имеют другую длину волны — явление, названное эффектом Рамана. Оно обусловлено тем, что возбужденные светом молекулы, потеряв избыточную энергию, не всегда возвращаются на исходный колебательный подуровень, поэтому свет, испускаемый ими, может иметь как меньшую, так и большую длину волны (антистоксовый и стоксовый эффекты). Волновые числа, определяющие отличие рамановских линий от линии возбуждающего света, соответствуют расположению колебательных энергетических подуровней в молекуле и располагаются в инфракрасной области. Регистрируемые этим методом колебания отвечают изменению поляризуемости молекулы, а не дипольного момента. Поэтому рамановски'е спектры дополняют информацию, полученную с помощью инфракрасной спектроскопии, и также используются для изучения структуры молекул.
