Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
154 Часть III. Аналитические методы.
1. Измерение поглощения следует проводить в дополнительной для цветной реакции области спектра. Так, если при реакции раствор окрашивается в желтый цвет, нужно измерять поглощение этим раствором синего света.
2. Исследовать цветную реакцию лучше всего в максимуме поглощения — этим достигается наибольшая чувствительность. Если положение максимума неизвестно, его следует определить. Такие предосторожности гарантируют получение хороших результатов даже на малочувствительном приборе.
3. В кювете с контрольным раствором обязательно должны содержаться все компоненты, кроме исследуемого вещества.
4. Контрольный раствор должен быть приготовлен очень тщательно, поскольку от этого зависит получение правильных результатов.
5. Если зависимость линейна, для получения хорошей градуировочной кривой нужно не менее пяти точек. Для нелинейной кривой их нужно существенно больше. Построение градуировочной кривой позволяет исключить точки, поглощение для которых получено ошибочно.
6. Измерение концентрации необходимо проводить дважды, и на кривую наносить оба значения, а не их среднюю величину. Такой способ построения наглядно показывает точность определения концентрации по полученной градуировочной кривой. Кроме того, он позволяет сразу обнаружить неправильные измерения по их сильному отклонению от кривой.
7. Калибровочные кривые, полученные с реагентами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реагента градуировочную кривую надо получить заново.
8. Наилучшая кривая, проведенная по всем экспериментальным точкам, не обязательно должна точно проходить через нуль. Это связано с тем, что для поглощающего контрольного раствора практически невозможно получить точно такое же соотношение всех компонентов, как для образца.
9. Не следует экстраполировать градуировочную кривую к значениям экстинкции, лежащим выше последних экспериментально полученных точек. Если нет крайней необходимости работать при поглощении, близком к 1,0, все измерения нужно проводить в интервале 0,0—-0,6, тогда результаты будут наиболее точными. Это связано с тем, что шкала поглощений логарифмическая.
10. Если поглощение образца лежит за пределами градуировочной кривой, надо заново приготовить раствор такой концентрации, чтобы попасть на градуировочную кривую. Можно поступить проще: разбавить образец, приготовленный для первого определения, одновременно разбавить точно так же и контрольную смесь. Эти операции правомочны, однако, лишь в том случае, если поглощение образца подчиняется закону Ламберта—Бэра. Обе пробы — и ис-
Гл. 5. Спектроскопические методы 155
следуемую, и контрольную — правильнее разбавлять таким же раствором, как и в контрольном препарате, но если концентрация реагента не важна, можно разбавлять оба раствора другим раство-рителем. Лучше, однако, не разбавлять растворы, а воспользоваться тонкими кюветами (с меньшим оптическим путем).
11. В колориметрических определениях воспроизводимость данных более важна, чем выполнение закона Ламберта—Бэра. Как и при всех аналитических процедурах, для экспериментатора важно именно совпадение данных, указывающее на точность количественного определения, а не конкретная схема проведения измерения. Результаты будут идентичны, если экспериментатор работает на исправной аппаратуре, тщательно измеряет все сливаемые объемы и контролирует время и температуру опыта.
Качественный анализ. Спектры в ультрафиолетовой и видимой областях применяются для идентификации соединений как в чистом виде, так и в составе биологических препаратов. Эта методика используется для определения химической структуры соединения и его превращения, однако для более точного анализа необходимы исследования поглощения в инфракрасной области (разд. 5.4).
Количественный спектрофотометрический анализ. Ряд важных биологических соединений можно полуколичественно изучать с помощью спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой областях, например, измеряя поглощение белков при 280 нм, а нуклеиновых кислот при 260 нм — длинах волн, соответствующих максимуму поглощения этих соединений. Экстинкция белка при 280 нм зависит от содержания в нем ароматических аминокислот — тирозина и триптофана, поэтому значения молярной экстинкции при 280 нм для всех белков различны, и для определения содержания каждого из них требуется индивидуальная калибровочная кривая. Как правило, биохимики работают со смесью белков, и тогда можно пользоваться градуировочной кривой, полученной для белка или смеси белков со средним содержанием тирозина и триптофана. Это может быть, например, сывороточный альбумин или смесь сывороточных белков. Таким образом, для контрольных измерений надо выбирать соответствующий белок. Проводя измерения при длинах волн, где примесь поглощает больше исследуемого вещества, можно с помощью соответствующих формул оценить количество примеси в образце. Так, пользуясь методом Мортона и Стубса, определяют содержание витамина А в омыленных экстрактах природных масел, а по соотношению экстинкций при 260 и 280 нм (Еш/rn) находят содержание белка в препарате нуклеиновых кислот.
