Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
166 Часть III. Аналитические методы
Поскольку римановское излучение очень слабое, соответствующие спектрофотометры появились лишь после развития лазерной техники. Рамановские спектрофотометры регистрируют колебания в видимой и ближней инфракрасной области даже для водных растворов биологических веществ, которые очень сильно поглощают в инфракрасной области. Тем не менее эта методика применяется в биохимии редко. В основном рамановская спектроскопия используется для исследования структуры органических молекул среднего размера.
5.6. Пламенная спектрофотометрия -
5.6.1. Принцип метода
Атомы веществ, испаряемые в пламени, испускают или погло щают свет определенной длины волны. Пламенная спектрофотометрия позволяет по интенсивности определенных линий в спектре определять количество отдельных элементов в веществе.
С наибольшей вероятностью элементы поглощают и испускают свет тех длин волн, которые соответствуют наиболее близко расположенным энергетическим уровням, например желтый свет D-линии натрия, отвечающий 3s—3р переходу (см. рис. 5.1,а). Поскольку переходы, которые могут совершать электроны в атоме, зависят от расположения занятых и свободных энергетических уровней, атомные спектры для разных элементовстрогоиндивидуальны.Теорети-чески для простых атомов по расположению линий в спектре можно установить их электронную структуру.
Свет, испускаемый атомом в пламени горелки, можно разложить на набор линий в спектроскопе, спектрографе и спектрофотометре. Эти приборы различаются по способу регистрации спектра, которым являются соответственно глаз, фотопленка и фотоэлемент.
Количество испускаемого света пропорционально числу возбужденных атомов, которое в свою очередь зависит от температу-ты и состава пламени. Для калибровки установки используется стандартный раствор. Состав пламени очень важен: натрий, например,* дает очень большую фоновую, эмиссию, поэтому его обычно измеряют в первую очередь и добавляют в одинаковых количествах ко всем стандартным растворам. Соли хлора более летучи, следовательно, исследуемые растворы должны содержать избыток соляной кислоты. Щелочные металлы усиливают эмиссию связанных с ними атомов, тогда как фосфаты, силикаты и алюминаты дают недиссоциирующие соли, тем самым подавляя эмиссию кальция и магния. К счастью, эту трудность можно обойти, добавив высвобождающие агенты лантан или стронций.
Для определения количества каждого компонента в образце, когда спектры перекрываются, проводят циклический анализ.
Гл. 5. Спектроскопические методы 167
Для этого приготавливают стандартные смеси, содержащие известное количество исследуемых компонентов, проводят несколько оценок, модифицируя состав смеси и постепенно приближая его к соотношению компонентов в образце. Обычно для определения состава образца бывает достаточно двух-трех циклов.
Из-за нестабильности пламени любое определение повторяют не менее трех раз. После окончания измерений следует проверять калибровочные кривые или снимать их снова. Для получения более точных результатов стандартный раствор, содержащий практически подобранное соотношение компонентов, исследуют до и после образца. Если можно, используют и внутренний стандарт; в качестве него обычно применяют литий.
Поскольку хорошо вымытое стекло даже высшего качества связывает и одновременно высвобождает ионы металлов, рекомендуется хранить образцы и стандартные растворы в полиэтиленовой посуде.
При определении металлов в биологических препаратах необходимо сначала сжечь органические молекулы. Это надо делать с осторожностью, чтобы не испарить заодно и легко испаряющиеся элементы. Для этого обугливают органические молекулы при довольно низких температурах в кислороде или жидкости —проводят окислительное разрушение образца смесью перекиси водорода с концентрированной серной кислотой. В качестве катализатора используют сульфат селена, а для повышения точки кипения добавляют сульфат лития.
Атомная абсорбционная спектрофотометрия используется для измерения поглощения монохроматического пучка света атомами в пламени. Поглощенная энергия пропорциональна числу атомов на пути луча.
5.6.2. Оборудование для атомной эмиссионной спектрофотометрии
Составные части атомного (пламенного) эмиссионного спектрофотометра приведены на рис. 5.9.
Распылитель. Это обычный пульверизатор, в котором сжатый воздух, проходя через капилляр, захватывает раствор с образцом. Образующиеся разного размера капли вместе с потоком воздуха попадают в пламя горелки: К сожалению, большие капли образца находятся в самом горячем месте пламени слишком мало времени, чтобы произошло их полное испарение. Поэтому образец пропускают предварительно через камеру с насыщенными парами, в которой большие капли оседают.
Пламя. В табл. 5.4 приведены состав газовой смеси и оптимальные температуры.
168 Часть III. Аналитические методы
Таблица 5.4
Состав газовых смесей и температуры, используемые в пламенной спектрофотометрии
Состав смеси Температура, Определяемые
