Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Гл. 5. Спектроскопические методы 149
дифракционных решеток в том, что можно увеличивать их разрешающую способность, поскольку она прямо пропорциональна плотности линий. Кроме того, во всем диапазоне длин волн дифракционные решетки имеют линейное разрешение, тогда как разрешение призменного монохроматора с увеличением длины волны уменьшается.
Кюветы. Исследуемое вещество растворяют в соответствующем растворе и помещают в оптически прозрачный сосуд для измерений— кювету. Обычно юоветодержатель имеет ячейки для четырех кювет. Если нет какого-нибудь известного стандартного вещества, для количественных измерений необходимо точно определить размеры кюветы. Для определения поглощения только исследуемого вещества используется кювета сравнения, идентичная кювете с образцом; в нее наливают только растворитель. Перед проведением измерений кюветы сравнивают. Поскольку стекло поглощает ультрафиолетовый свет, для проведения измерений в этой области спектра используют кварцевые кюветы. Для работы с летучими или химически активными веществами кюветы закрывают пробками.
Поскольку кювета, помещенная в спектрофотометр, становится составной частью его оптической системы, с ней нужно обращаться очень аккуратно. Царапины и грязь на стенках кюветы сильно рассеивают и поглощают свет, искажая результаты измерений. Об этом особенно надо помнить при работе в ультрафиолетовой области. Поскольку органические молекулы поглощают в ультрафиолетовой области, ни в коем случае нельзя касаться руками оптических стенок кюветы и вообще стараться по возможности меньше брать кюветы в руки. Раствор лучше заливать в кюветы, поставив их в предварительно вынутый из прибора юоветодержатель. Манипулируя с пипеткой, надо помнить, что кюветы довольно хрупки, особенно кварцевые, поэтому заполнять их нужно, не касаясь стенок пипеткой.
Содержимое кюветы должно быть гомогенным — это необходимое условие получения воспроизводимых данных. Нужно следить за тем, чтобы раствор не был мутным. Особенно мешают измерениям пузырьки воздуха, сильно увеличивающие рассеяние. Нельзя наливать в кювету очень холодный раствор, поскольку при этом на наружных стенках кюветы конденсируются пары воды воздуха, и стенки становятся непрозрачными.
Если кюветы загрязнены посторонними примесями, их следует промыть дистиллированной водой и (или) растворителем, в котором растворено исследуемое вещество. Кюветы можно мыть мягкими серными детергентами, но стараться не пользоваться горячими концентрированными кислотами или щелочами, а также другими травящими агентами.
Как правило, для работы применяют кюветы с оптическим путем 1 см, заливая в них 2,5—3 см3 раствора. В такие кюветы входит
150 Часть Ш. Аналитические методы
4—5 см3, но заполняют их полностью лишь в том случае, когда это необходимо. Есть кюветы с оптическим путем 100, 20, 5, 2 и 1 мм. В последние — микрокюветы — входит мало вещества, 0,3—0,5 см3,
и, конечно, в том случае, когда объем ограничен, эти кюветы очень удобны, например при работе с НАД-Н.
Чтобы спектрофотометр работал хорошо, стабильно и долго, его следует держать в чистой комнате, при постоянной влажности и температуре. Для работы при разных температурах используют специальные термостатированные кюветодержатели. При помощи спектрофотометров можно анализировать соединения после хроматографического разделения их на колонках. Для непрерывного анализа вытекающего из колонок раствора имеются специальные проточные кюветы. В последнем случае результаты измерений целесообразно непрерывно записывать на самописце регистрирующего спектрофотометра.
Фотоэлементы. Фотоэлементы преобразовывают световую энергию в электрическую. Электрический сигнал затем усиливается и регистрируется.
Фотоны, бомбардируя поверхность фотоэлемента, выбивают из нее электроны, количество которых пропорционально интенсивности света. Эти электроны летят к положительному электроду; в результате в замкнутой цепи возникает электрический ток, который регистрируется по падению напряжения на сопротивлении, находящемся в этой цепи. Напряжение можно усилить, и после компенсации такого сигнала потенциометром, отградуированном в единицах поглощения, на датчике регистрируется непосредственно поглощение образца.
Обычные фотоэлементы наиболее чувствительны к свету с длиной волны Я~400 нм и мало чувствительны к свету с длинами волн X > 550 нм. Поэтому для работы в этой области необходимы специальные фотоэлементы, обладающие достаточной чувствительностью в данном спектральном диапазоне. Теоретическая точность таких фотоэлементов 1+0,003 единиц поглощения, т. е. 0,3%.
Фотоумножители более чувствительны, чем простые фотоэлементы. Это происходит из-за того, что электроны, вылетевшие из фото-чувствительного слоя, ускоряются высоким напряжением, а из-за соударений в газе возникают вторичные электроны, что и приводит к возрастанию тока.
Ширина щели. Измеряемая экстинкция, как правило, зависит от размера щели. Эго обусловлено двумя факторами: во-первых, от размера щели зависит диапазон длин волн света, падающего на образец, а, во-вторых, чувствительность фотоэлемента зависит от длины волны. Поэтому для получения надежных данных надо работать при минимально узкой для данных условий эксперимента щели. Если щель выбрана правильно, при изменении ее размеров вдвое экстинкция не меняется.
