Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Количество двух компонентов, имеющих перекрывающиеся спектры, например хлорофиллы а и Ь в эфире, можно оценить, зная их экстинкцию при двух длинах волн. Для п компонентов надо иметь данные по поглощению при п длинах волн.
156 Часть III. Аналитические методы
Количественное определение ферментов и кинетический анализ.
В том случае, когда продукт или субстрат ферментативной реакции имеет характерный спектр поглощения, можно определить количество присутствующего в смеси фермента, а по спектральным изменениям хромофора в ходе реакции — исследовать и кинетику этой реакции. Количественное определение гидролитических ферментов проводят при помощи реакций расщепления ими синтетических субстратов, в результате которых высвобождается окрашенный продукт (например, а-глюкозидаза отщепляет р-нитрофенол от р-нитрофенил-а-О-глюкопир анозида).
Количественное определение деполимераз (например, эластазы) проводят по измерению ферментативного высвобождения красителя из комплекса полимера с красителем (эластин-^конго красный).
Эти методы используются и в тех случаях, когда непосредственных спектральных изменений в смеси не происходит, но продукт ферментативной реакции участвует в другой реакции, которая уже идет с изменением поглощения. Например, альдолаза катализирует превращение фруктозо-1,6-дифосфата в глицеральдегид-3-фос-фат и дигидроацетонфосфат. Глицеральдегид-З-фосфат-дегидроге-наза восстанавливает НАД+, и появление НАД-Н сопровождается изменением поглощения при 340 нм. Таким образом, альдолазу можно определить по кинетике появления НАД-Н в присутствии избытка фруктозо-1,6-дифосфата, глицеральдегид-3-фосфат-дегид-рогеназы и НАД+ (рис. 5.4). Восстановление НАД* или окисление НАД-Н осуществляется в ходе большого числа метаболических реакций. Все описанные измерения можно проводить на довольно дешевых спектрофотометрах, работающих в спектральном диапазоне до 340 нм, и даже пользоваться стеклянными кюветами. Поскольку НАД+ и НАД-Н сравнительно дороги, лучше иметь кюветы тоньше 1 см.
м., Разностные спектры. Основное преимущество разностной спект-рофотометрии состоит в том, что с ее помощью можно изучать небольшие изменения поглощения системы с большим значением экстинкции, например изменение окислительного состояния компонентов дыхательной цепи в целых фосфорилиругощих митохондриях и хлоропластах.
Разностный спектр получается вычитанием одного абсолютного спектра поглощения из другого, например вычитанием абсолютного спектра поглощения убихинола из спектра убихинона (рис. 5.5). На практике такой разностный спектр получается, если в кювету сравнения поместить одно вещество, в данном случае убихинол, а в кювету для образца — другое, в данном случае убихинон.
фруктозо-1,6-дифосфат
церальдвгид-
} НАД*
у. гтЦЕРАЛЬДЕГИД-З-фОШТ-/ -ДЕГИДРОГЕНАЗА
™W*+H+
Субстрат
«ЕШЕт||
Продукт- На-
W
Г ПРОДУКТ- Щ^ДЕГИДРОГЕНАЗА
Продукт+НАДН+Н*'
6
Рис. 5.4. Взаимосвязанные ферментативные реакции, использующиеся для опрелеления ферментативной активности альлолазы (я) и Других ферментов
(б):
Рис. 5.5. Абсолютные (а) и разностный (б) спектры поглощения убихииона
и убихинола.
158 Часть III. Аналитические методы
Рис. 5.5, на котором приведена разность спектров убихинона и убихинола, иллюстрирует, следующие основные свойства разностных спектров:
а) значения экстинкции могут быть отрицательными;
б) максимумы и минимумы поглощений смещены, а значения экстинкций отличаются от их значений на абсолютных спектрах;
в) точки нулевого поглощения — изобестические точки — отвечают длинам волн, где восстановленные и окисленные формы вещества поглощают одинаково; изобестические точки используются для обнаружения посторонних веществ.
Поместив в кювету сравнения анаэробные митохондрии, а в кювету для образца такие же митохондрии в присутствии окиси углерода, мы получим разностный спектр цитохрома ОдСО и цитохрома Од, поскольку цитохром а3 — последний переносчик электронов в цепи и единственный компонент митохондрий, реагирующий с окисью углерода.
Часто термином «разностный спектр» при исследовании дыхательных систем обозначают разностный спектр восстановленных и окисленных форм. Например, разностный спектр цитохрома с означает разницу в поглощении цитохрома свосст и цитохрома сокисл. Для суспензии митохондрий разностный спектр получается регистрацией при определенных длинах волн изменения поглощения, когда исследуемый объект переходит, напротив, из аэробного состояния в анаэробное; при этом получается «суммарный разностный спектр» для цитохромов а, Од, Ъ, с, съ НАД+ и флавопро-теидов.
Спектры действия. Спектр действия — это зависимость какого-либо неоптического параметра системы от длины волны. Даже для сложных биологических систем такой спектр соответствует спектру поглощения соединения, ответственного за чувствительность системы к свету. Так, изменение скорости выделения кислорода листьями зеленых растений в зависимости от длины волны падающего света эквивалентна спектру поглощения хлорофилла.
