Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Турбидиметрия и нефелометрия (измерение мутности). Очень разбавленные суспензии можно количественно исследовать при помощи турбидиметрии, т. е. измерения экстинкции не в полосе поглощения вещества. К счастью, рассеяние света зависит от длины волны значительно слабее, чем поглощение. Рассеяние света меняется с концентрацией нелинейно, поэтому стандартизовать измерение концентрации разбавленных суспензий по уменьшению интенсивности попадающего на фотоэлемент света довольно трудно. Концентрацию бактерий обычно оценивают при длине волны 600 нм.
Нефелометрия — это метод измерения интенсивности рассеянного суспензией света; он применяется в основном для определения концентрации микроорганизмов.
Гл. 5. Спектроскопические методы 159
5.3. Спектрофлуориметрия
5.3.1. Природа флуоресценции
Флуоресценция — это испускание молекулой света. Спектр флуоресценций соединения сдвинут в длинноволновую область по сравнению со спектром его поглощения; этот сдвиг называется стоксовым. Иногда вещество поглощает в ультрафиолетовой области, а испускает видимый свет.
При комнатной температуре большинство органических молекул находится в основном состоянии (на рис. 5.1,6 оно обозначено 50V0). Поглощение фотона сопровождается переходом электрона на более высокий энергетический уровень (Si, Sz и т. д.). Это происходит за 10-15 с. После поглощения кванта молекула из-за теплового движения и столкновения с другими молекулами растрачивает часть энергии и переходит на самый нижний колебательный подуровень первого электронного возбужденного состояния (SjF0). Испустив квант за 10~8 с, молекула переходит в основное состояние; такое испускание света называется флуоресценцией. Уменьшение энергии кванта, испущенного молекулой, по сравнению с энергией поглощенного кванта и есть стоксовый сдвиг. Флуоресцируют отнюдь не все органические молекулы, хотя большинство из них поглощает в ультрафиолетовой и (или) видимой области.
Поскольку переход с первого возбужденного состояния в основное может происходить на различные колебательные и вращательные подуровни, спектры флуоресценции имеют вид полос. Они обычно не зависят от длины волны возбуждающего света и зеркально симметричны спектрам поглощения.
Спектры флуоресценции несут информацию о процессах, протекающих быстрее, чем за 1СГ8 с. Квантовый выход Q — отношение числа испущенных квантов света к числу поглощенных — обычно не зависит от длины волны К возбуждающего света. При малых концентрациях молекул интенсивность флуоресценции If связана с интенсивностью падающего света 10 соотношением
If = /0 • 2,3 •e*c*d,Q.
If аг экстинкции Е зависит линейно и составляет примерно 1/100 X ХЕ, если экстинкция не превышает 0,2. Обычно значение Е = 0,1 указывается с точностью до 1%, т. е. значение экстинкции 0,101 принимается равным просто 0,1.
5.3.2. Оборудование
Интенсивность флуоресценции сильно зависит от температуры; при уменьшении ее от 30 до 20°С она падает на 10—50%* поэтому
160 Часть III. Аналитические методы
при измерениях необходимо тщательно контролировать температуру.
На рис. 5.6 приведена общая схема устройства флуориметра. Он состоит из:
1) источника света с широким спектральным диапазоном (например, ртутная или ксеноновая лампа);
2) монохроматора Мь выделяющего свет определенной длины волны для возбуждения образца;
j
Рис. 5.6. Схема устройства спектрофлуориметра.
1 — источник света; 3 — монохроматор 1; 3 — образец; 4—монохроматор 2; 5 — фотоэле-
' мент-детектор; 6 — усилитель; 7 — к самописцу.
3) второго монохроматора М2, который установлен для определения спектра флуоресценции образца при постоянной длине волны возбуждения;
4) детектора — обычно это чувствительный фотоэлемент; для измерения же флуоресценции при длинах волн больше 500 нм используется фотоумножитель, чувствительный к красному свету;
5) усилителя.
Для регистрации спектра возбуждения образца его освещают светом различных длин волн; поворачивая монохроматор Mlt измеряют флуоресценцию при постоянной длине волны (М2 неподвижен). Спектр флуоресценции снимают при неподвижном Мх (в этом случае образец освещается светом постоянной длины волны) и измеряют флуоресценцию при различных длинах волн, перемещая М2. В самых простых флуориметрах М2 отсутствует, Мх заменен фильтром, а в качестве источников света используются ртутная, ксеноновая или водородная лампы. Такой прибор, измеряющий общую интенсивность свечения, применяется для количественных исследований однокомпонентных систем.
Гл. 5. Спектроскопические методы 161
5.3.3. Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией
Благодаря тому что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации вещества, во флуориметрах используется сравнительно простая электроника. Спектрофлуориметрические методы обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры поглощения регистрировать очень трудно; по флуоресценции можно обнаружить, например, 0,01 мкг катехоламинов или НАД• Н. Чувствительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, усиливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хорошей спектральной селективностью, поскольку благодаря стоксо-вому сдвигу можно использовать два монохроматора — один настроенный на длину волны возбуждающего света, а другой — на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюветы сравнения, но надо иметь калибровочную кривую.
