Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Гл. Б. Спектроскопические методы 151
Обычно нулевое значение поглощения устанавливают щелью, но в хороших спектрофотометрах это делают, изменяя усиления тока или напряжения фотоэлемента. Такая регулировка позволяет работать при постоянной ширине щели.
Регистрирующие спектрофотометры (рис. 5.3, б). Такие приборы могут регистрировать как изменение поглощения вещества в зависимости от длины волны, так и изменение поглощения во времени при постоянной длине волны. Конечно, регистрирующие приборы очень удобны в работе, но надо помнить, что часто такие спектрофотометры имеют меньшую чувствительность, чем более дешевые однолучевые приборы, поскольку в них из-за автоматической регулировки щели возникают дополнительные шумы. Основная разница между одно- и двухлучевыми приборами состоит в том, что в последних исходный луч при помощи системы плоских зеркал направляется то в кювету сравнения, то в кювету с образцом. Разница в этих прошедших световых потоках, улавливаемых фотоумножителем, соответствует значению поглощения вещества. В хороших спектрофотометрах бумага самописца может двигаться с разной скоростью, поэтому спектры можно растягивать по длинам волн. Изменение чувствительности самописца позволяет усиливать или ослаблять сигнал, поступающий от спектрофотометра, так что на всю его шкалу можно уместить значения экстинкции О—0,1, 0—1, 1—2 или 2—2,1.
Есть спектрофотометры с автоматической сменой ячеек; на них можно последовательно измерять поглощение нескольких образцов через заданные промежутки времени.
Более сложные спектрофотометры. Иногда бывает необходимо исследовать соединения, поглощающие при длинах волн К < 200 нм. В этой области начинает поглощать кислород воздуха, поэтому для измерений в вакуумном ультрафиолете из системы нужно откачать воздух. Кварц начинает поглощать ниже 190 нм, но эту трудность можно обойти, изготовив оптические детали из фтористого лития, который прозрачен до 110 нм.
Спектрофотометры, учитывающие отражение, — это приборы, улавливающие свет, рассеянный образцом во все стороны. Такие измерения проводят тогда, когда образец сильно рассеивает в области поглощения (например, суспензия бактерий). В этом случае поглощение находят после измерения всего рассеянного и прошедшего света, и истинное значение оптического пути неизвестно. Этот факт сильно усложняет обработку экспериментальных данных. В качестве сравнения применяется рассеивающая поверхность из окиси магния.
Многолучевой регистрирующий спектрофотометр регистрирует изменение экстинкции одновременно при двух выбранных длинах волн. Выпускаются и приборы, работающие при нескольких длинах волн.
Таблица 5.3
Общие колориметрические количественные определения
Вещество "¦ Реагент Длина волны, нм Ссылка
Неорганические Молибдат аммония, 660 13
фосфата HaS04; 1, 2,4-амино-
нафтол, NaHSOg,
NaaSOs
Аминокислоты Нингидрин 570 (пролин 420) 16, 23
Соли меди 620 или '230 20
Белки (пептидные NaOH, (K.Na) виннокис 540 10
связи) лый, CuS04
Фенол, тирозин 660 (750) 14
Белки Реактив Фолина 660 ' 14
Биурет 540 10
Углеводы Фенол, H2S04 Разная (например, 7
для глюкозы ---
490, для ксило
зы---480)
Антрон (антрон, H2S04) 620 или 625 3, 19
Восстановленные 540 2
сахара
Пентозы] 665 15
Цистеин, H2S04 380---4163 4
Гексозы Карбазол, этиловый 540 или 440 11
спирт; H2S04
Цистеин, H2S04 380---415 4
