Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Основная трудность, возникающая при флуориметрическйх изменениях, — это тушение флуоресценции, когда энергия возбуждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения.
5.3.4. Применение
Качественный анализ. Получение н сравнение спектров флуоресценции и возбуждения соединений позволяет идентифицировать и изучать эти соединения.
Количественный анализ. Флуориметрия широко применяется в биохимических исследованиях благодаря своей высокой точности, чувствительности и воспроизводимости получаемых результатов. Это особенно важно при работе с малыми количествами вещества, когда спектрофотометрия не дает надежных результатов. В качестве примера можно привести количественное исследование витамина Bi в пищевых продуктах, НАД-Н в митохондриях и микроорганизмах при различных метаболических условиях, АТФ, хлорофилла и кортикостероидов. Использование внутренних стандартов, т. е. измерение флуоресценции неизвестных количеств чистого вещества до и после добавления определенного количества стандартного образца, позволяет исследовать как самотушение, так и тушение флуоресценции примесями.
Исследование ферментов и кинетический анализ. Группоспецифические гидролитические ферменты можно исследовать по скорости появления флуоресценции аниона 4-метилумбеллиферона при 450 нм. Спектры поглощения и флуоресценции его приведены на рис. 5.7.
НАД* - и НАДФ+ -зависимые реакции (разд. 5.2.1). Поскольку НАД-Н и НАДФ-Н флуоресцируют, спектрометрию можно приме-
162 Часть III. Аналитические методы
Рис. 5.7. Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) аниона метилумбеллиферона и его производных при pH 10.
280 320 360
Длина волны, нм
400
нить для изучения различных метаболических реакций, которые так или иначе связаны с окислением НАД-Н или НАДФ-Н или восстановлением их протонированных форм. Благодаря высокой чувствительности метода ферментативные реакции изучают при низких концентрациях субстрата, фермента или кофакторов, т. е. в условиях, близких к протеканию реакций in vivo; при этом иногда даже не приходится добавлять экзогенные кофакторы. Метод позволяет изучать ки-Длина волны, нм нетику окисления и восстановления
6 эндогенного соединения в интактных
органеллах или клетках, например НАД+ митохондрий.
Исследование структуры белков. Поскольку некоторые белки содержат флуоресцирующие хромофоры, например тирозин и ФАД, по изменению их флуоресценции можно исследовать связывание белков с такими веществами, как ингибиторы, коферменты и аллостерические факторы. С помощью флуоресценции исследуют также конформацию и полимеризацию белков.
5.4. Инфракрасная спектрофотометрия
Инфракрасная область электромагнитного излучения делится на ближнюю инфракрасную (1—2 мкм), инфракрасную (2—25 мкм) и дальнюю инфракрасную области (25—250 мкм). Наиболее часто применяется область 2,5—20 мкм.
5.4.1. Природа инфракрасного излучения
Для асимметричной молекулы, состоящей из п атомов, согласно теории молекулярных колебаний, возможны Ъп—6 нормальных колебаний, из которых 2га—5 приводит к деформации связей и га—1 — к их растяжению. На рис. 5.8 эти колебания изображены для двуокиси углерода. Колебания, сопровождающиеся изменением ди-польного момента, т. е. смещения заряда, наблюдаются в инфра-
Гл. 5. Спектроскопические методы 163
красной области. Другие колебания регистрируются с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния (рамановской спектроскопии). Итак, инфракрасные спектры абсолютно специфичны, поэтому их можно считать своеобразными «отпечатками-пальцев» молекул. Инфракрасные спектры для таких простых молекул, как двуокисть углерода И вода, идентифицировать довольно просто, но для биохимии интересны молекулы очень большого размера;
Колебания прирастят-• нии связей
S~
СЬ
S-
0-
ныеколебания О"
-С-
-с-
-с-
s-
0
е-
-0
5-
-0
I t I
Без изменения дипомного момента
С изменением
дипвльного
момента
Рис. 5.8. Основные колебания в молекуле двуокиси углерода'(стрелки показывают одновременное относительное смещение атомов).
молекула же, содержащая 50 атомов, имеет 144 нормальных колебания.
К счастью, благодаря ряду факторов ситуация существенно упрощается. Некоторые полосы в инфракрасных спектрах разных молекул появляются при одних и тех же длинах волн и относятся к одинаковым группам атомов в молекулах. Это аналогично спектрам поглощения хромофоров. Такие «группы частот» — важный элемент при анализе спектров (поскольку инфракрасные спектры— это колебательные спектры, их принято строить в частотах, а не длинах волн). Весьма полезен для аналитических целей тот факт, что поглощение группы атомов в молекуле зависит от их окружения — частоты колебаний смещаются в ту или иную сторону. Так удается различить колебания С—Н-связи в группах =СН2 и —СН3. При увеличении энергии связи атомов, например при образовании двойных связей, частота колебаний растяжения связей увеличивается, т. е. уменьшается длина волны поглощенного света. При увеличении приведенной массы связанных атомов А и В
