Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
нм1СГ1 Ю'г 1Q'3 10* 10~5 Ю6 10~7 КТ*нм
11СГ’ 10* 10* 10* 10
Y-e—ь—h—Ь----------h
in Ь 1П * 1D 3 т
„Длина волны
см Ю'е 10* 10"* 10~3 io* icr1 i 10 см
Процесс г Электронный ,| Колебательный д с Вращательный и ЭПР д ЯМР
(валентные оболочки)
ТЦ 10№ 10'* 10м 1013 10,г 10" 10ю Щ
Частота -------------1____.____I------ -1------- —-L__________________._I-.-1_ I ¦
смгЧО6 10s 104 103 102 Ю' 1 10~1 см'1
гБодородная лампа Источник тт
I решетка дтвкло^ Z
Монохроматоры! .Кварц _ —L I
^ Ъ’лористый натрий --------!--------1 \ПР^»‘
^ Бромистый калий----------------1J
{
„Синий"фотоэлемент Детекторы, 4 *%емешп>0т0~{ . Элемент ТЬлея
¦ Вакуумная . термопара
Рис. 5.2. Электромагнитный спектр и спектральные характеристики спектрофотометра.
Обычно электронные переходы сопровождаются изменениями в колебательных и вращательных энергетических уровнях. Эта область спектроскопии широко применяется в биохимии (разд. 5.2— 5.6). При переходе электронов в основное состояние происходит испускание света — флуоресценция (разд. 5.3).
Колебательно-вращательные спектры обусловлены изменением энергии колебательных подуровней. Такие переходы, как правило, происходят в ближней инфракрасной области и сопровождаются изменениями вращательных энергетических подуровней. Этот вид спектроскопии обычно используется для изучения структуры биологических макромолекул в неводных средах.
Вращательные спектры располагаются в далекой инфракрасной и микроволновой областях и в биохимии используются редко.
Рамановские спектры (спектры комбинационного рассеяния света) обусловлены изменением колебательных и вращательных подуровней одновременно (разд. 5.5). Такие переходы происходят в близкой инфракрасной области, и рамаНовская спектроскопия дополняет информацию, полученную с помощью вращательных и колебательно-вращательных спектров. В биохимии рамановская спектроскопия применяется редко.
Гл. б. Спектроскопические методы 145
Спектры электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резонанса обусловлены изменением направления спинов соответственно электронов и ядер в магнитном поле. Эти методы являются мощным инструментом при изучении структуры биологических макромолекул (разд. 5.7—5.8).
5.1.3. Основные законы поглощения света
При прохождении света через равномерно поглощающую среду его интенсивность /0 уменьшается до величины /. Отношение интенсивностей прошедшего и падающего света 1/10 называется пропусканием Т. Поглощение А или жапинкция Е — это величина, равная lg ЦТ = lg /„//. Некорректный термин «оптическая плотность» применять не следует.
Согласно закону Ламберта—Бэра, экстинкция пропорциональна концентрации поглощающего вещества и толщине образца, т. е.
Е = гей,
где е — коэффициент молярной жстинщии поглощающего вещества при длине волны Я, с — молярная концентрация раствора, d — оптический путь, или толщина образца в см.
Пропускание обычно измеряется в процентах и меняется от О до 100%. Экстинкция — величина безразмерная и изменяется от 0 до оо. Соотношения между этими величинами приведены в табл. 5.1. Поскольку коэффициент молярной экстинкции, как правило, довольно большой, используют другую величину — поглощение света образцом толщиной в 1 см, содержащим однопроцентный раствор исследуемого вещества
Таблица 5.1
Связь доли поглощенного света с пропусканием и екстинкцией
• Пропускание Т
Поглощенный % ДОЛЯ 1/Г Экстинкция
свет. % ? = lg 1/Г
0 100 1,0 I 0,00
25 75 0,75 1,3 0,12
50 50 0,50 2 0,30
75 25 0,25 4 0,60
83 17 0,17 6 0,95
90 10 0,10 10 1,00
95 5 0,05 20 1,30
99 1 0,01 100 2,00
99,9 0,1 0,001 1000 3,00
100 0 0 оо оо
6—502
146 Часть III. Аналитические методы
Закон Ламберта—Бэра применим не для всех систем. Во-первых, при поглощении света образец может ионизоваться, а при высоких концентрациях — полимеризоваться. Иногда образец при облучении коагулирует, образуя мутную суспензию. Эти эффекты увеличивают или уменьшают экстинкцию.
Иногда используемый прибор чувствителен к рассеянному свету или же испускает свет в ограниченном диапазоне длин волн.
5.2. Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях
